溶瘤腺病毒治疗膀胱癌进展

陈 猛，郝 林(综述)，韩从辉※(审校)

(1.东南大学医学院，南京210009;2.东南大学医学院附属徐州医院泌尿外科，江苏徐州221009)

膀胱肿瘤是我国泌尿外科最常见的肿瘤，约占全部恶性肿瘤的3.2%，且发病率逐年增高。在欧美一些国家，膀胱肿瘤在泌尿生殖系统中仅次于前列腺癌而居第二位。目前，治疗膀胱癌的主要方法是以手术为主，辅以膀胱内灌注化疗和免疫治疗药物，但复发率高，治疗效果远不能让人满意。溶瘤腺病毒又称条件增殖型腺病毒，其在正常细胞中复制能力很低而在肿瘤细胞中则可以特异性复制，通过腺病毒的增殖来裂解肿瘤细胞，释放出的子代腺病毒可以继续感染周围肿瘤细胞进一步杀伤肿瘤。自2003年首次报道溶瘤腺病毒治疗膀胱肿瘤以来，人们对溶瘤腺病毒治疗膀胱癌进行了大量的研究。

1 腺病毒的生物学特征及特点

腺病毒(adenovirus)是一种由252个壳粒呈二十面体排列构成的直径为70～90 nm的无包膜双链DNA病毒。腺病毒具有以下诸方面的优点:①嗜上皮细胞性;②既可以感染分裂期细胞又可以感染非分裂期细胞;③对人致病性低;④同时表达多个基因;⑤外源性基因表达水平高;⑥插入外源基因容量大;⑦病毒基因组发生重排较少;⑧有效进行增殖;⑨滴度高;⑩不整合到宿主染色体。人体腺病毒目前已经鉴定有51个血清型。这51型腺病毒可以根据血凝反应、对啮齿类动物的致瘤性、DNA的同源性和基因组的结构分为 A、B、C、D、E、F亚属。目前应用的腺病毒载体主要是在人类腺病毒C亚群的Ad2和Ad5的基础上构建的。

腺病毒对细胞的感染始于纤维蛋白与靶细胞表面的腺病毒受体(coxsackievirus-adenovirus receptor，CAR)结合，腺病毒黏附后，五邻体蛋白上的精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸序列与细胞表面的整合素ανβ3和ανβ5结合形成内体使病毒进入细胞，CAR起到黏附病毒的作用，整合素起到了内化病毒的作用，他们各司其职，相互配合。两者对于腺病毒的感染是缺一不可的。

2 溶瘤腺病毒的构建机制

目前认为，细胞由G1期进入S期，是腺病毒复制的必要条件。E2F转录因子可使细胞从G1期进入S期，而视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，Rb)蛋白可与E2F结合，阻止细胞进入S期。腺病毒感染细胞后，E1A蛋白与Rb蛋白结合释放E2F，促进细胞由G1期进入S期，但E2F同时也促进p14ARF和cyclin E等物质的产生，其中p14ARF通过Mdm2(泛素连接酶途径)减少p53降解并在核仁周围聚积;p53与细胞周期停滞基因和凋亡诱导基因上游的p53反应子结合从而阻止细胞进入S期或诱导细胞凋亡。而E1b蛋白可与p53结合并使之失活，最终使大量宿主细胞由静止期进入分裂期，腺病毒得以复制。

可见E1A和E1B基因是腺病毒在正常细胞中复制所必需的基因，通过改变或调控E1A和(或)E1B基因就可以构建相应的溶瘤腺病毒，如去除E1A或E1B基因的腺病毒在Rb和p53细胞信号通路正常的宿主细胞中无法进行复制增殖，但在Rb或p53信号通路异常的肿瘤细胞中则可以增殖并使细胞受损。

3 溶瘤腺病毒治疗膀胱癌的研究

3.1 E1B缺失腺病毒治疗膀胱癌 p53基因突变是人膀胱癌中最常见的基因缺陷，大约50%的膀胱癌发生p53基因突变，且p53基因突变与移行细胞癌的高分期、高分级相关。腺病毒的E1B-55蛋白可以结合p53并使之失活，从而促使腺病毒复制。Hsieh等［1，2］构建了 E1B 缺失腺病毒 Ad5WS1，研究发现Ad5WS1可在p53突变的J82和TCC-SUP细胞中复制，J82细胞中的腺病毒产量是在293细胞中的10.34倍，但在TSGH-8301和BFTC-905中分别是293细胞的0.87%和1.52%。BFTC-173-12细胞感染Ad5WS1出现严重的细胞病变效应:感染3 d后，细胞生存率降到了50%。

3.2 E1A突变腺病毒治疗膀胱癌 Fueyo等［3］通过删除E1A区域的24 bp构建了溶瘤腺病毒Δ24，Δ24腺病毒可以高效地在肿瘤细胞中复制并溶解肿瘤细胞。研究显示，Δ24感染人胶质瘤细胞10～14 d后可观察到大多数的肿瘤细胞溶解。体内实验也显示，单剂量使用Δ24腺病毒可导致裸鼠66.3%的肿瘤生长抑制，而多次注射Δ24腺病毒抑制肿瘤生长可高达83.8%。但正常的成纤维细胞和Rb活性正常的癌细胞可抵抗 Δ24腺病毒。Wang等［4］研究发现，E1A突变腺病毒dl 922-947对膀胱癌细胞株J82 5637和T24的细胞病变效应要大于E1B-55KD缺失腺病毒AxE1AdB，但未报道这种差异是否有统计学意义。

3.3 E1A突变和E1B缺失双限制腺病毒治疗膀胱癌 Wang等［4］构建了E1A突变和E1B-55缺失腺病毒 AxdAdB-3，并以 E1区缺失腺病毒 AxCAlacZ，E1B-55缺失腺病毒 AxE1AdB和E1A突变腺病毒dl 922-947为对照组进行体外和体内研究AxdAdB-3的治疗膀胱癌效果。体外研究结果显示，AxdAdB-3比AxE1AdB和dl922-947有更大的细胞病变作用;体内研究结果显示，AxdAdB-3治疗的膀胱肿瘤体积最小，重量比对照组明显减小。AxdAdB-3治疗的小鼠生存率明显增加，且多次灌注比单次灌注更明显的增加了小鼠的生存率。此外，AxdAdB-3比单突变腺病毒对正常细胞有更小的毒性。

3.4 特异性启动子调控溶瘤腺病毒治疗膀胱癌Terao等［5］构建了由肝素结合细胞因子(midkine，MK)启动子控制E1A基因的腺病毒(Ad-MK-E1A)并检测了Ad-MK-E1A在细胞中的复制能力，转染率以及细胞毒性。结果发现MK mRNA高表达的细胞系(KK47，5637)比MK mRNA低表达的细胞系(T24，H891)含有更多的E1A DNA;对KK47、5637、T24、A549 和H891 细胞的转染率分别为(3.2×1010±0.9×1010)BTU/mL，(5.7 ×109±0.7 ×109)BTU/mL，1.0 ×107BTU/mL，(1.35×109±0.35 ×1010)BTU/mL，和(3.8 ×109±0.1×109)BTU/mL;Ad-MK-E1A不能抑制H891细胞的生长，在第7 天，21%的 T24，35.5%的 A549，56.8%的KK47和71.6%的5637细胞生长被抑制。随后用KK47细胞建立了皮下肿瘤动物模型进行动物实验研究，结果Ad-MK-E1A明显抑制肿瘤生长。

Shirakawa等［6］构建了由环氧化酶2(cyclooxygenase 2，Cox-2)启动子控制E1A基因的腺病毒(AdE3-cox2-327)。体外实验发现，AdE3-cox2-327不能抑制T24、PC3、Colo320、PF 和 H358 细胞生长，但能明显抑制表达Cox-2和CAR的KK47，5637和A549细胞生长。KK47、5637和A549细胞比H358细胞含有更多的E1A DNA，这证实了AdE3-cox2-327是有选择性地复制。体内试验发现，AdE3-cox2-327比Ad5CMV-LacZ和空白对照组更能抑制KK47肿瘤的生长。

Oct-3/4高表达于膀胱肿瘤，而不表达于正常成熟细胞组织，它在肿瘤生成过程中起着重要的作用［7，8］。Wu 等［9］构 建 了 由 ORE(Oct-3/4 response element)结合CMVmini启动子控制的E1B缺失腺病毒Ad.9OC。研究发现，Ad.9OC的细胞溶解性效应与Oct-3/4的表达水平呈正相关。进一步实验证实了Ad.9OC比Ad5WS1(E1B-55×103阙如腺病毒)具有更强的细胞溶解性效应。动物实验发现，Ad.9OC增加了MBT-2/LM7肿瘤小鼠的生存率，但仅少许增加了MBT-2肿瘤小鼠的生存率。

Ramesh等［10］用 E2F-1启动子和编码 GM-CSF的cDNA分别取代了Ad5的E1A启动子和E3gp19×103编码区构建了溶瘤腺病毒CG0070。研究发现在Rb途径缺陷的细胞中，CG0070中的E2F启动子可以调控E1A基因的转录和下游调节人GMCSF的E3启动子的表达。在Rb途径缺陷的人膀胱移行细胞癌细胞系RT4、SW780、UC14和253J B-V中，CG0070和野生型腺病毒Ad5一样产生相似水平的子代病毒(3000～9000 PFU/细胞);而在Rb阳性的正常细胞中，CG0070的复制能力急剧衰弱。以3×1010、3×109、3×108的 CG0070病毒量和磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)分别瘤内注射治疗进行动物实验研究，发现60 d后PBS组的肿瘤体积增加了10.6倍，3×109、3×108CG0070Z 组的肿瘤体积增加了2倍，而3×1010CG0070组的肿瘤体积降至85%;最高剂量CG0070治疗组有一半(5/10)肿瘤完全退化。

Melquist等［11］构建了由骨唾液蛋白(bone sialoprotein，BSP)启动子调控 E1A基因的腺病毒Ad-BSP-E1A。研究发现BSP阴性，CAR阳性的253J和253J B-V细胞易于感染Ad-BSP-E1A，BSP和CAR阴性的T24细胞是耐Ad-BSP-E1A的。BSP和CAR阳性的RT4细胞非常易感Ad-BSP-E1A。动物试验中PBS和Ad-BSP-TK治疗3周后的肿瘤平均体积分别增加了140%和67%，而Ad-BSP-E1A组减少了10%。治疗7周后，PBS组肿瘤体积增加了2000%，而Ad-BSP-E1A和Ad-BSP-TK组分别增加了45%和76%。但由于样本量较小，难以评估其统计学意义。

尿溶蛋白(uroplakins，UPs)是一组哺乳动物尿路上皮分化时合成的高度保守的膜内在蛋白。Zhang等［12］在E1A上游插入hUPⅡ启动子，用TRES连接E1A和E1B区构建了腺病毒CV876，而后在CV876的基础上删除E1B-19×103编码区构建了腺病毒CG8840。实验结果说明，CV876和 CG8840在 RT4和SW780细胞中能很好地复制，但在非膀胱细胞中(G316、LNCaP、hLFs和 hBSMCs)复制能力很差。CG8840在膀胱癌细胞中比CV876有更大的病毒释放量，而在非膀胱癌细胞中复制能力相似。动物实验发现，CG8840瘤内注射治疗5周后肿瘤体积减小到50%而空白对照组肿瘤体积增加到310%。联合治疗试验显示多西紫杉醇治疗10 d后存活了50%的细胞，而多西紫杉醇联合CG8840治疗10 d后，全部细胞被杀死。等效线图解法说明CG8840和多西紫杉醇具有协同作用。同样，CG8840联合其他化疗药物，如多柔比星、丝裂霉素C、塞替哌、米托蒽醌和长春碱也具有协同作用。动物实验研究表明，治疗7周后，空白对照组肿瘤增加320%，然而CG8840和联合组(CG8840联合多西紫杉醇)肿瘤减小甚至没有肿瘤。治疗5周时，CG8840组的6只小鼠中有2只触及不到肿瘤，还有2只小鼠的肿瘤减小了50%以上;联合组的6只小鼠中3只小鼠没有肿瘤，另外3只小鼠的肿瘤减小了80%。由于UPⅡ也表达于正常的膀胱组织，Wang等［13］在UPⅡ启动子上游插入肿瘤特异性前列腺干细胞抗原强化因子来限制其在非膀胱细胞中的活性。研究表明，肿瘤特异性前列腺干细胞抗原强化因子联合UPⅡ启动子构建膀胱癌特异性载体是可行的。

Lanson等［14］用人端粒酶反转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)启动子调控E1基因的表达构建了腺病毒Ad5-hTERT-E1。研究表明，Ad5-hTERT-E1可以在所有的肿瘤细胞中(HT-1080、HeLa、A549、HepG2、SCC-4、SCC-5、SCCLSU-1、T24 和DU145)导致细胞溶解而对正常细胞(成纤维细胞、呼吸道上皮细胞和骨髓间质干细胞)则没有作用。

在肿瘤增殖过程中发生缺氧是一种普遍现象，此时细胞内许多基因的转录和表达发生变化，对缺氧作出应激反应，这些反应主要是通过缺氧启动子1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)完成的。李怀富等［15，16］研究30 例正常膀胱组织未发现 HIF-1α 阳性表达，80例膀胱组织中有43例HIF-1α表达阳性，阳性表达率占53.75%。其表达与肿瘤的大小、部位、数目、病理分级以及患者年龄无关，但与肿瘤的临床分期及分级明显相关。随后构建了由hTERT启动子控制E1A基因，HIF-1启动子控制E1B基因的双调控溶瘤腺病毒，使其更加特异地在肿瘤细胞中表达而在正常细胞中不表达，并以此为超抗原SEA基因载体进一步包装成溶瘤腺病毒-hTERT-缺氧启动子-超抗原复合物(RSOAds-hTERT-HIF-SEA)，该复合物既具有高效的靶向膀胱肿瘤特点，又具有强大的细胞毒T淋巴细胞刺激能力，同时又能够直接裂解杀伤肿瘤细胞，进而对膀胱肿瘤细胞产生强大的多重靶向治疗效果。胡建鹏等［17］将淋巴细胞与膀胱肿瘤细胞共培养12、24、48 h，加入该溶瘤腺病毒组的肿瘤细胞明显少于对照组，酶联免疫吸附法检测白细胞介素4分泌量，实验组均高于对照组。

4 存在的问题和展望

首先，膀胱上皮的氨基葡聚糖层作为非特异性隔离屏障可能阻碍腺病毒的感染能力，十二烷基-β-D麦芽糖苷或十二烷基硫酸钠预处理的膀胱使用腺病毒15 min后有＞90%膀胱层转染腺病毒，而未处理的膀胱≤5%转染腺病毒［18，19］。不过使用药物消除或减弱氨基葡聚糖层可以使腺病毒到达膀胱上皮表面而提高治疗效果。

其次，膀胱癌的CAR表达下降将降低溶瘤腺病毒的感染能力，进而影响到治疗效果。Li等［20］研究发现，RT4和253J膀胱癌细胞株易于感染腺病毒，而TCC和T24膀胱癌细胞株却抵抗腺病毒感染，而后检测到RT4细胞的CAR是T24的20倍左右。Sachs等［21］报道正常膀胱上皮、浅表性膀胱癌和浸润性膀胱癌的CAR表达分别为90.0%、83.3%和31.3%，低分级TCC和高分级TCC细胞的CAR表达分别为83.3%、39.5%，CAR的表达与膀胱癌的分期与分级相关。因此，如何增加腺病毒治疗低表达甚至不表达CAR的膀胱癌也是一个急需解决的问题。Shieh等［22］研究发现，低剂量的依托泊苷可以上调膀胱癌的CAR表达水平。此外，改变腺病毒的感染途径也可以增加它对CAR缺乏细胞的感染性和特异性，一种方法是修饰腺病毒基因组来改变腺病毒衣壳的结合特异性，另一种是在腺病毒的衣壳上衔接一个具有特异性结合亲和力的耦联蛋白。

最后，溶瘤腺病毒治疗膀胱癌还需要大量的临床试验，将溶瘤腺病毒用于临床治疗膀胱癌还有一段距离。相信，随着科学的进步，对膀胱癌研究的深入和生物工程、基因工程的发展，总有一天人们会攻克膀胱癌。

［1］Hsieh JL，WU CL，Lai MD，et al.Hepatitis B virus X protein sensitizes hepatocellular carcinoma cell to cytolysis induced by E1B-deleted adenovirus through the disruption of p53 function［J］.Clin Cancer Res，2003，9(1):338-345.

［2］Hsieh JL，Wu CL，Lai MD，et al.Gene therapy for bladder cancer using E1B-55kD-deleted adenovirus in combination with adenoviral vector encoding plasminogen kringles 1-5［J］.Cancer Res，2003，88(9):1492-1499.

［3］Fueyo J，Gomez-Manzano C，Alemany R，et al.A mutant oncolytic adenovirus targeting the Rb pathway produces anti-g lioma effect in vivo［J］.Oncogene，2000，19(1):2-12.

［4］Wang H，Satoh M，Abe H，et al.Oncolytic viral therapy by bladder instillation using an E1A，E1B double-restricted adenovirus in an orthhotopic bladder cancer model［J］.Urology，2006，68(3):674-681.

［5］Terao S，Shirakawa T，Kubo S，et al.Midkine promoter-based conditionally replicative adenovirus for targeting midkine-expressing hunman bladder cancer model［J］.Urology，2007，70(5):1009-1013.

［6］Shirakawa T，Hamada K，Zhang Z，et al.A cox-2 promoter-based replication-selective adenoviral vector to target the cox-2-expressing human bladder cancer cells［J］.Clin Cancer Res，2004，10(13):4342-4348.

［7］Gidekel S，Pizov G，Bergamn Y，et al.Oct-3/4 is a dose-dependent oncogenic fate determinant［J］.Cancer Cell，2003，4(5):361-370.

［8］Atlasi Y，Mowla SJ，Ziaee SA，et al.Oct-4，an embryonic stem cell marker，is highly expressed in bladder cancer［J］.Int J Cancer，2007，120(7):1598-1602.

［9］Wu CL，Shieh GS，Chang CC，et al.Tumor-selective replication of an oncolytic adenovirus carrying Oct-3/4 response elements in murine metastatic bladder cancer model［J］.Clin Cancer Res，2008，14(4):1228-1238.

［10］Ramesh N，Ge Y，Ennist DL，et al.CG0070，a conditionally replicating granulocyte macrophage colony-stimulating factor-armed oncolytic adenovirus for the treatment of bladder cancer［J］.Clin Cancer Res，2006，12(1):305-313.

［11］Melquist JJ，Kacka M，Malaeb BS，et al.Conditionally replicating adenovirus-mediated gene therapy in bladder cancer:an orthotopic in vivo model［J］.Urol Oncol，2006，24(4):362-371.

［12］Zhang J，Ramesh N，Chen Y，et al.Identification of human uroplakinⅡ promoter and its use in the construction of CG8840，a urothelium-specific adenovirus variant that eliminates established bladder tumors in combination with docetaxel［J］.Cancer Res，2002，62(13):3743-3750.

［13］Wang D，Wang Z，Tian J，et al.Prostate stem cell antigen enhancer and uroplakinⅡpromoter based bladder cancer targeted tissuespecific vector［J］.Urol Oncol，2010，28(2):164-169.

［14］Lanson NA Jr，Fridlander PL，Schwarzenberger P，et al.Replication of an Adenoviral vector controlled by the human telomerase reverse transcriptase promoter causes tumor-selective tumor lysis［J］.Cancer Res，2003，63(22):7936-7941.

［15］李怀富，韩从辉，董秉政，等.缺氧启动子-1α在膀胱癌中的表达及其意义［J］.中华实验外科杂志，2009，26(3):361-362.

［16］李怀富，韩从辉，郝林，等.表达金黄色葡萄球菌肠毒素A基因的高靶向、双调控溶瘤腺病毒载体的构建、鉴定及其抗膀胱肿瘤作用［J］.中华实验外科杂志，2009，26(8):1052-1054.

［17］胡建鹏，郝林，张培影，等.双调控溶瘤腺病毒介导超抗原SEA基因靶向膀胱肿瘤表达［J］.中华实验外科杂志，2010，27(8):1131-1133.

［18］Lilly JD，Parsons CL.Bladder surface glycosaminoglycans is a human epithelial permeability barrier［J］.Surg Gynecli Obstet，1990，171(6):493-496.

［19］Ramesh N，Memarzadeh B，Ge Y，et al.Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium［J］.Mol Ther，2004，10(4):697-705.

［20］Li Y，Pong RC，Bergelson JM，et al.Loss of adenoviral receptor expresiion in human bladder cancer cell:a potential impact on the efficacy of gene therapy［J］.Cancer Res，1999，59(2):325-330.

［21］Sachs MD，Rauen KA，Ramamurthy M，et al.Integrin аν and coxsackie adenovirus receptor expression in clinical bladder cancer［J］.Urology，2002，60(2):531-556.

［22］Shieh GS，Shiau AL，Yo YT，et al.Low-dose etoposide enhances telomerase-dependent adenovirus-mediated cytosine deaminase therapy through augmentation of adenoviral infection and transgene expression in a syngeneic bladder tumor model［J］.Cancer Res，2006，66(20):9957-9966.