生长因子对肌腱细胞表型及分化的影响

邱轶伟(综述)，朱理玮(审校)

(天津医科大学总医院普通外科，天津300052)

肌腱断裂是外科难题，不但修复起来很困难而且人们对肌腱的愈合过程知之甚少。依靠对细胞的生化过程进行操控，组织工程可以改善目前肌腱和韧带损伤后外科手术效果［1-3］。目前肌腱组织工程中的关键因素有三个:细胞支架、肌腱细胞和宿主反应［4，5］。本篇综述将对肌腱细胞研究中的几个难点进行讨论。目前肌腱细胞体外培养中的难点在于，首先，从肌腱中提取的肌腱细胞非常稀少，然而过多的传代培养将导致肌腱细胞表型的变异［6］;其次，肌腱细胞的体外培养依赖大量的动物血清添加于培养基中以达到细胞的存活和增殖，而动物血清的使用会增加未来移植时对宿主的疾病传播的可能性。

肌腱细胞存在于肌腱中，沿肌腱胶原纤维的长轴平行排列，这些细胞可以依靠特异的细胞突起和间隙连接形成的压力感受系统以达到细胞之间的互相交流，这样肌腱细胞就可以调控它们的细胞外基质。对于组织工程来讲，能够维持细胞表型是最基本的要求［7］。然而，有研究显示［8］，兔的肌腱细胞数次传代培养后即出现了表型的变异，人跟腱提取的肌腱细胞在体外培养8次传代后即出现了明显的表型变异。这些表型变异体现在肌腱细胞的生长特性和细胞外基质成分的变化。细胞外基质的纤丝样和非纤丝样成分，基质-细胞相互作用的递质均可作为肌腱细胞的表型变异以及肌腱细胞应激反应的标志物。

已有学者试图在肌腱细胞的体外培养的培养基中加入生长因子以达到促进肌腱细胞增殖和分化的目的，然而，多种生长因子的相互作用在无血清条件下对于肌腱细胞的作用人们仍不清楚。在这篇综述中，首先对肌腱细胞的表形标志物进行讨论，然后讨论那些有可能在无血清状态下维持肌腱细胞表型的生长因子。

1 肌腱表型标志物

1.1 Ⅰ型胶原 正常肌腱内的主要结构的组成就是Ⅰ型胶原，Ⅰ型胶原占超过肌腱干重量的70%。在肌腱内，胶原纤维的分布是纵行层结构分布，也就是说从最纤细的微纤维，次纤维和纤维分层有序的排列以形成肌腱的组织架构。Ⅲ型胶原是胶原纤维家族成员之一，其与Ⅰ型胶原结构类似但其为同源三聚体分子(Ⅰ型胶原为异源三聚体分子)。Ⅲ型胶原的单体链依靠永久性二硫键结合在一起，而在Ⅰ型胶原中，其单体链依靠暂时性C-前肽二硫键结合。有研究认为，Ⅲ型胶原在Ⅰ型胶原纤维的形成过程中起重要作用，因为Ⅲ型胶原能够经常与Ⅰ型胶原共存，甚至有研究报道在同一个肌腱纤维里同时发现Ⅰ型和Ⅲ型胶原［9］。Ⅲ型胶原在肌腱中存在的量非常小，然而，一旦出现肌腱损伤或者断裂，Ⅲ型胶原的比例就会显著增加，Ⅲ型胶原增加后的结果就是肌腱的力学特性严重变差。使用兔肌腱细胞进行体外单层长期培养的结果就是，Ⅰ型胶原的产生随传代次数的增加明显减少。

1.2 Scleraxis Scleraxis是碱性螺旋-环-螺旋结构的转录因子，它是非常特异的结缔组织标志物，而这些结缔组织正是调控鸡和鼠的肌肉与骨的连接部位，包括四肢的肌腱。最早小鼠Scleraxis基因的发现是在寻找一种新的组织特异的螺旋-环-螺旋蛋白的过程中发现的，借助于这些蛋白易与广泛存在的螺旋-环-螺旋蛋白易于形成异源二聚体的优势发现的小鼠Scleraxis基因。Scleraxis选择性地表达于肌腱细胞，而且不但调控肌腱细胞内的Ⅰ型胶原的基因表达［10］，而且还调控肌腱细胞分化标志物Tenomodulin的基因表达［11］。Scleraxis基因剔除的研究显示，Scleraxis在肌腱发育过程中起到至关重要的作用。Scleraxis基因缺失的小鼠不但严重缺乏肌腱导致腿，背和尾部的活动受限，同时肌腱内肌腱细胞和细胞基质混乱排列。基于上述结果，有理由认为，Scleraxis通过调控Ⅰ型胶原在肌腱细胞分化和肌腱组织形成过程中起到至关重要的作用［12］。

1.3 Decorin Decorin是存在于包括肌腱在内的多种结缔组织中细胞外基质中的低分子量蛋白多糖。从肌腱中提取的Decorin对于Ⅰ型和Ⅱ型胶原纤维的形成有抑制作用，并且可以降低胶原纤维的直径［11］。然而，Decorin不仅仅抑制胶原纤维的形成，有研究显示Decorin同时具有调控胶原纤维形成的作用。目前还无法清晰阐述Decorin调控胶原纤维生成的机制，但有学者提出假说认为，Decorin减缓平行生长的胶原纤维融合以得到肌腱内更均匀、更细的胶原纤维［12］。Decorin不但能够使得肌腱内的胶原纤维更有序排列，而且还能稳定胶原纤维的形成过程［13］。更重要的是，Decorin借助其在肌腱中的胶原纤维表面的相互作用以影响肌腱的强度和弹性。

1.4 Tenomodulin Tenomodulin是一个Ⅱ型跨膜糖蛋白家族中的一员，它主要表达于肌腱，韧带和眼，这个家族的其他成员ChondromodulinⅠ主要表达于软骨，只有少量表达于眼和胸腺［12］。克隆小鼠Tenomodulin全长cDNA后显示其与小鼠ChondromodulinⅠ全长cDNA的前体有33%相同［12］。然而，Tenomodulin缺乏Chondromodulin所具备的激素处理信号，提示Tenomodulin是具有细胞表面的Ⅱ型跨膜蛋白的功能。Shukunami等［14］的研究发现，虽然肌肉纤维和肌腱外膜都被定义为少血管的致密结缔组织，但Tenomodulin的mRNA基因表达与肌肉纤维无关联性，但与肌腱外膜关联密切。有研究显示，Tenomodulin缺陷小鼠的新生肌腱中严重缺乏可增殖的肌腱细胞，所以Tenomodulin对于肌腱细胞的增殖和成熟是必不可少的［15］。Shukunami等［11］认为在鸡的发育过程中，Tenomodulin的表达与肌腱细胞密切相关，而且被Scleraxis正向调控，研究结果提示，Tenomodulin是肌腱形成的后期标志物，而且 Scleraxis对于Tenomodulin的表达的调控是依赖于肌腱细胞系的。有研究显示，在肌肉生长抑制素基因剔除的小鼠肌腱细胞内的Scleraxis和Tenomodulin的表达较未剔除的小鼠明显降低，但这些肌腱细胞再给予了能够激活p38MAPK和Smad2/3信号级联系统肌肉生长抑素处理后，Scleraxis和Tenomodulin的表达均得到了提高［16］。

2 可促进肌腱细胞增殖和分化的生长因子

2.1 胰岛素样生长因子1 胰岛素样生长因子最早被发现的时候被称为“硫酸化因子”，因为它是一种具备生长激素下游反应的能够刺激软骨硫酸化的血清因子。后来因为其能够刺激细胞增长又被命名为促生长因子。与此同时，其他学者的研究发现一种血清因子具有胰岛素样活性，但是其活性不能被抗胰岛素抗体所抑制，所以被命名为“不可抑制的胰岛素样活性”。局部作用的胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor，IGF-1)可以直接与其受体结合，而进入循环的IGF-1要与血清中的六种IGF结合蛋白(IGFBP-1～6)中的一种相结合，主要是IGFBP-3［17］。当IGF结合蛋白裂解后，IGF与其分离，在其他结合蛋白的帮助下离开血管进入目标组织，再与其细胞表面的IGF-1酪氨酸激酶受体结合后引发一系列细胞内信号转导通路［17］。

循环IGF-1大多在肝脏在生长激素的作用下合成［17］。局部作用的IGF-1可以从很多不同的组织中产生，例如，角质形成细胞、成骨细胞和成纤维细胞，在这些细胞中IGF-1的合成是由生长激素和甲状旁腺激素所调控。性激素可以在子宫中调控IGF-1的合成。在人类胎儿大部分组织中均存在IGF-1，其在胎儿中对发育的作用是极其重要的。有实验结果显示，IGF-1对成纤维细胞、软骨细胞、角质形成细胞、成骨细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、乳腺上皮细胞、胸腺细胞、甲状腺滤泡细胞、神经细胞、肾小球膜网织红细胞、卵母细胞、颗粒细胞、精原细胞的发育均有重要作用。IGF-1可以与如此多的细胞类型相结合，所以IGF-1具有广泛的生理和病理作用。局部作用的IGF-1在伤口愈合方面也有相当重要的作用，局部缺乏IGF-1严重影响愈合过程，局部外用IGF-1可以逆转激素的不良反应。

已经有学者研究了IGF-1在肌腱愈合方面的作用。目前尚无发表的研究结果能够显示肌腱损伤后存在IGF-1的水平升高。体外兔肌腱细胞培养的研究显示，重组的IGF-1对于肌腱细胞增殖与基质合成有显著的刺激作用，此作用在10～250 μg/L的范围内为剂量依赖性。在胶原酶诱导的肌腱炎的动物模型中，局部注射IGF-1的肌腱愈合效果要优于注射生理盐水对照组。经过了3～4周的治疗，与对照组相比，注射IGF-1的实验组水肿较轻，肌腱强度加大，缺损较小，肌腱细胞增殖和胶原产生增加。

2.2 碱性成纤维细胞生长因子 碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)最早是从牛垂体提纯出来的具有对成纤维细胞促有丝分裂作用的物质。后来这种物质还具有对于细胞的其他特性，例如，促进血管再生、促进伤口愈合及胚胎发育的作用。从伤口愈合的角度讲，bFGF对于角质形成细胞的增殖和迁移有促进作用［18］。还能促进成纤维细胞合成胶原酶［19］，刺激毛细血管内皮细胞的增殖，不但这些都对新生血管的产生是必要的，而且还能够促进肉芽组织的产生。碱性成纤维细胞生长因子参与了各个器官的发育、重建，包括新生血管的产生、动脉粥样硬化的形成、血管损伤后的内皮修复、肺的发育、神经的发育、眼睛的发育、前列腺的发育、肌肉的发育以及伤口愈合［20］。有研究报道，外用bFGF可加速髌韧带肌腱损伤模型的愈合，其机制可能为bFGF有效刺激了肌腱细胞的增殖。这个结果与其他研究人员的研究结果相一致，将bFGF注入损伤髌韧带肌腱损伤模型中，其Ⅲ型胶原与肌腱细胞的增殖均有明显的提高［21］。有研究指出，屈肌腱受损后修复过程中的第1～56天，肌腱内的bFGF的水平明显升高;腱鞘内的肌腱细胞，成纤维细胞以及炎性细胞内的bFGF水平达到了最高，这些结果均显示bFGF在肌腱愈合过程中起到了相当重要的作用［20］。外用bFGF可导致肌腱细胞的Integrin表达增加，而Integrin调控细胞之间，细胞与基质之间的联系，提示肌腱损伤后bFGF协调肌腱的愈合过程。体外培养实验显示，与小剂量(3 μg/L)bFGF相比，大剂量(30 μg/L)的bFGF对于肌腱细胞的的增殖，细胞密度和基因表达均有强烈的抑制作用。应用大剂量的bFGF 14和28 d后，肌腱细胞的Ⅰ型胶原，Ⅲ型胶原和纤连蛋白的表达较对照组明显降低。所以，可以假设bFGF对于细胞的影响是剂量依赖性的。

2.3 血小板衍生生长因子 血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)最早是从血小板内衍生出来的能够刺激成纤维细胞和平滑肌细胞增殖的促有丝分裂物质。目前很多研究的方向就是为了阐明PDGF在创伤愈合中发挥作用的机制，特别是因为PDGF是急性创伤后最早出现的生长因子。在早期的创伤愈合中，PDGF诱导其他生长因子的合成，例如，IGF-1，而且PDGF是在成纤维细胞增殖和分化，胶原的沉积以及新生血管的产生的级联信号转导中的初始步骤［22］。体外培养实验中，PDGF刺激肌腱细胞的胶原和蛋白多糖的产生以及DNA合成。因为PDGF上调IGF-1和IGF-1受体的表达，所以PDGF有可能通过非直接的方式对IGF-1的作用进行控制。有研究显示，1 μg/L PDGFBB可以逆转10－6mol/L地塞米松所造成的肌腱细胞增殖速率减慢和胶原形成减少［23］。所以，PDGF对于不同的细胞可以有许多不同的作用，包括刺激细胞增殖、胶原产生和新生血管的产生。

2.4 转化生长因子β 转化生长因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)最早在 1983 年被发现，当初这是一种胎盘衍生物并能够刺激成纤维细胞在软凝胶中增殖。自从被发现以后，就广泛引起关注和作为研究的对象，因为此物质的生物活性作用范围很广，而且在全身各个组织中均存在其作用部位。TGF-β几乎在全身各种细胞中都可以产生，而且几乎每种细胞均对其有反应［24］。TGF-β在不同的细胞中有不同的作用，有些包括调节细胞周期，胚胎形成及器官发育［16］。在创伤愈合方面，TGF-β从脱颗粒的血小板中释放出来，同时被各种参与愈合的各种细胞分泌出来，这些细胞包括淋巴细胞、巨噬细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、上皮细胞以及成纤维细胞［25］。数个研究表明，外用TGF-β可以逆转因为年龄和激素的使用造成的伤口愈合不良［20］。然而，TGF-β除了具有促进愈合的作用以外，它的另外一个作用就是过多的无序胶原沉积使其成为组织纤维化和瘢痕形成的主要因子。在伤口愈合，肾小球肾炎和肝硬化的动物模型中，TGF-β水平的升高与病理性瘢痕形成有密切关系。有研究发现，在肌腱损伤以后，肌腱外膜和肌腱内的TGF-β的mRNA水平均有显著升高，特别是富含肌腱细胞的腱鞘部位，在上述相同部位的TGF-β受体的表达也有升高［25］。体外培养肌腱细胞的研究表明，培养基中加入1～5 μg/L的TGF-β的三种同工型均可使得肌腱细胞的胶原产生增多，但同时也减少细胞数量［26］。

3 小结

该文肌腱细胞外基质的纤维性的和非纤维性的组成部分可以用于作为肌腱细胞表型的标志物以及可能会对肌腱细胞的增殖和分化造成影响的几种生长因子。这些肌腱细胞表型标志物可以用于判断肌腱细胞在不同培养条件下的功能性的变化，借此帮助研究者了解各种生长因子及其组合应用于肌腱细胞后对其产生的作用。

目前已有数项研究致力于在体外培养肌腱细胞时在培养基内加入生长因子，以期减少胎牛血清的使用。然而，这些研究所采用的细胞培养时间较短，使用的生长因子较为单一，且所得到的结果不甚统一，无法适用于组织工程学所需要的长期培养。所以，研究方向的假说就是，在肌腱细胞的体外培养中使用多种生长因子的组合使之有可能模拟体内的内环境，使得肌腱细胞可以充分利用培养基内的营养物质以使得胎牛血清变得可有可无。该文所提到的几种生长因子的正确组合非常有可能帮助建立一个无血清的体外培养肌腱细胞的环境，并能促进细胞增殖和分化，同时对于肌腱细胞表型变化的研究能使人们对肌腱组织工程有进一步的了解。

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