HPLC-MS/MS测定大鼠血浆中丹参素钠的浓度

王 晶，金 磊，熊礼燕，王庭芳, 2，郑莉萍, 2，张 宁，邹 豪，张 川

(1．第二军医大学药学院新药研究中心，上海 200433；2．福建中医药大学药学院，福建 福州 350108；3．上海市徐汇区中心医院，上海 200031)

HPLC-MS/MS测定大鼠血浆中丹参素钠的浓度

王 晶1，金 磊1，熊礼燕1，王庭芳1, 2，郑莉萍1, 2，张 宁3，邹 豪1，张 川1

(1．第二军医大学药学院新药研究中心，上海 200433；2．福建中医药大学药学院，福建 福州 350108；3．上海市徐汇区中心医院，上海 200031)

目的建立液质联用色谱法(HPLC-MS/MS)测定SD大鼠血浆中丹参素钠的浓度。方法血浆样品采用液液萃取方法进行预处理。色谱柱为Diamonsil C18柱(4.6 mm×200 mm，5 μm)；流动相为甲醇-水(含0.01‰甲酸)=(80:20)；流速为1.0 ml/min；质谱条件：采用ESI离子源，负离子检测，选择MRM测定丹参素钠和酮洛芬197→135 m/z和253→209 m/z。结果丹参素钠在10.6 ～1 060 ng/ml检测浓度范围内呈良好的线性关系(r=0.999 6)，最低定量限为10.6 ng/ml，日内和日间精密度的RSD<7.8 %，回收率在99 %到102 %之间。结论该方法灵敏度高、快速、简单、准确，适用于血浆样品中丹参素钠的含量测定以及临床前实验研究。

丹参素钠；HPLC-MS/MS；血药浓度

丹参来源于唇形科植物丹参(SalviamiltiorrhizaBge.)的干燥根及根茎。丹参有扩张冠状动脉，防止心肌缺血[1]，促进血液循环[2]，降血脂，消炎抗菌作用[3]。丹参主要分为脂溶性和水溶性成分[4]。水溶性成分中丹参素的含量较高，活性较强，作为丹参的质量控制指标成分。

丹参素[D(+)-β-(3，4-二羟基苯基)-乳酸]具有抗炎、抗氧化[5]、抗血栓、抗心肌缺血、抗肿瘤[6]等作用，并且能清除自由基和抗氧化[7]，抑制血小板聚集[8]，改善微循环，调节血脂代谢等作用[9]。常用的检测方法有LC-UV[10～12], LC-FLD[13], LC-DAD[14]。本文采用HPLC-MS/MS方法建立了SD大鼠血浆样品中丹参素钠的含量测定方法。

1 材料与仪器

1.1药品和试剂 丹参素钠对照品(中国药品生物制品检定所，纯度99.6 %)，酮洛芬对照品(中国药品生物制品检定所，含量95.6 %)，甲醇为美国Merck公司生产的色谱纯试剂，乙酸乙酯为上海胜德化工有限公司生产，甲酸为FEDIA公司，浓盐酸为国药集团化工有限公司生产，水为去离子水。

1.2仪器 VARIAN 1200L液相色谱-质谱联用仪，包括VARIAN ProStar 210高压泵，VARIAN ProStar 410自动进样器，VARIAN 1200L Quadrupole MS/MS仪，VARIAN MS 6.8 工作站。XW-80A旋涡混合器(上海医科大学仪器厂)，CR3i台式高速冷冻离心机(ThermoFisher公司)，thermofisher SPD121减压离心浓缩(ThermoFisher公司)，HA-202M电子天平(A&D Company LTD)。

2 方法与结果

2.1实验条件

2.1.1色谱条件 色谱柱：Diamonsil C18，(200 mm×4.6 mm，5 μm)柱温25 ℃ ，流动相：甲醇-水(含0.01‰甲酸)=(80:20)，采用等梯度洗脱方式，流速 0.80 ml/min，3:2分流入质谱的流速为0.32 ml/min，进样量20 μl，分析时间9.0 min。

2.1.2质谱条件 采用气动辅助电喷雾离子化电离源(ESI)，负离子方式检测；喷雾电压(SP)4700V；加热毛细管温度(TEM)为250 ℃；碰撞气(CID)压力1.65 mTorr；源内碰撞诱导解离(Source CID)能量为18.0 V；质谱扫描方式为多反应监测(MRM)，分别测定丹参素钠和酮洛芬反应离子m/z 197→135和m/z 253→209；扫描时间为0.5 s。

2.2 标准溶液的制备 ①丹参素钠标准溶液：精确称取丹参素钠对照品10.6 mg，用甲醇配制成浓度为1.06 mg/ml的标准溶液，-80℃保存待用，1个月后重新配制。②酮洛芬标准溶液(内标)：精确称取一定量酮洛芬，用甲醇配制成浓度为102.4 ng/ml的内标溶液，-80 ℃保存待用，1个月后重新配制。

用丹参素钠对照品配成一系列浓度的标准溶液，分别取各浓度标准溶液10 μl于90 μl空白血浆中，使丹参素钠的血浆终浓度分别为10.6、21.2、53、106、212、530、1 060 ng/ml，余同血浆样品的处理和测定。

2.3血浆样品的前处理方法 精密量取血浆样品100 μl，置于1.5 ml的塑料离心管中，加入50 μl内标(酮洛芬甲醇溶液，102.4 ng/ml)，涡旋30 s，再加入50 μl的盐酸溶液(3 mol/L)，涡旋30 s，再加入1 ml乙酸乙酯，涡旋3 min, 离心(5000 r/min )10 min分层，取上清800 μl转移至另一1.5 ml塑料离心管中，冷冻离心机吹干，100 μl流动相复溶，涡旋1 min，离心(12 000 r/min)10 min，取上清20 μl进样检测。

2.4分析方法的专属性 按上述LC-MS/MS条件测得6只SD健康大鼠的空白血浆；空白血浆+丹参素钠标准样品+内标；受试大鼠静脉注射丹参素钠后的血浆样品质量色谱图，见图1。丹参素钠与酮洛芬的保留时间分别为6.7 min和7.0 min，由图可见血浆中内源性物质不干扰测定。

2.5线性范围与定量限 将不同浓度系列标准样品测得的丹参素钠与内标峰面积比值为纵坐标，丹参素钠浓度为横坐标，直线加权回归。结果表明血浆中丹参素钠浓度在10.6～1 060 ng/ml范围内浓度与峰面积有良好的线性关系y=0.003528x-0.031(r=0.999 6)。方法的最低定量限为10.6 ng/ml(S/N>10)，其RSD值为9.8%。

2.6精密度与回收率 按丹参素钠标准曲线制备方法制备质控样品，对21.2，106和 848 ng/ml 3种浓度进行了连续3 d的5份样本分析，以评价方法的日内、日间精密度。同时以流动相代替空白血浆，同样方法配制高、中、低3种浓度(21.2、106、848 ng/ml )的标准样品，计算回收率。低、中、高3个浓度的准确度分别为(21.08 ± 1.54)、(106.52 ± 4.12)、(846.04 ± 5.22) ng/ml；日内精密度分别为 7.30、3.87、0.64%；日间精密度分别为5.42、3.57、0.55%；提取回收率分别为(100.46 ± 5.44)%、(101.88 ± 3.64)%、(99.11 ± 0.54)%。

2.7分析样品的稳定性 将丹参素钠标准溶液配制的(21.2、106、848 ng/ml)的血浆样品，按上述操作进行稳定性考察：血浆样品室温放置2 h的稳定性；血浆样品处理后放置4 h的稳定性；室温与-80 ℃冻融3次的稳定性；-80 ℃保存20 d的稳定性。每个浓度点测定5份样品与放置0 h的样本进行比较，计算后各浓度变异均小于15%，稳定性符合指导原则。

3 讨论

3.1血浆样品前处理方法的选择 实验开始时尝试使用蛋白沉淀法，空白血浆中出现干扰或杂质，而且提取回收率低，因此选择回收率高，选择性好的液液萃取方法，乙酸乙酯作为萃取溶剂。

3.2流动相的选择 实验中发现甲醇对丹参素钠色谱行为影响较大，流动相中甲醇比例越高，丹参素钠保留时间越长，柱效下降，峰形较差。实验中还发现，流动相为甲醇-水(含0.01‰甲酸)=(80:20)时，丹参素钠及其内标物酮洛芬的峰形较好，响应强度最大，故选择甲醇-水(含0.01‰甲酸)=(80:20)为流动相。

4 结论

建立了测定SD大鼠体内丹参素钠血药质量浓度LC-MS/MS法。血浆中无干扰测定的内源性物质，线性范围为10.6～1 060 ng/ml，定量下限为10.6 ng/ml，批内、批间精密度均小于7.8%，回收率在99%～102%之间。该方法灵敏，简单，准确，可用于SD大鼠血浆中丹参素钠的含量测定及其临床前试验研究。

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2011-03-01

[修回日期] 2011-03-07

DeterminationofsodiumDanshensuinratplasmabyHPLC-MS/MS

WANG Jing1, JIN Lei1, XIONG Li-yan1, WANG Ting-fang1, 2, ZHENG Li-ping1, 2, ZHANG Ning3, ZOU Hao1, ZHANG Chuan1

(1. New drug research center, School of Pharmcy, Second military medical university, Shanghai 200433, China; 2. School of Pharmacy, Fujian university of traditional Chinese medcine , Fuzhou 350108, China; 3. Central Hospital of Xuhui District, Shanghai 200031, China)

ObjectiveTo estiblish a method of determining sodium Danshensu in rat plasma by HPLC-MS/MS.Methodssodium Danshensu was extrated for determination by HPLC-MS/MS. Analytical column was Diamonsil C18(4.6 mm×200 mm ,5 μm). The mobile phase was methanol:water (0.01‰ formic acid )= 80:20. Mass spectrum conditions were ESI performing in the MRM mode using target ions m/z 197→135 (Sodium Danshensu), m/z 253→209 (ketoprofen).ResultsThe calibration curve was liner over the range of 10.6～1 060 ng/ml. The LLOQ of sodium Danshensu in plasma was 10.6 ng/ml. The intra-day and inter-dayRSDwere<7.8%. The extracted recovery was ranged from 99% to 102%.ConclusionThe method was sensitive, rapid, simple and accurate to sodium Danshensu plasma concertration and suitable to study preclinical test of sodium Danshensu.

sodium Danshensu; HPLC-MS/MS; plamsma concentration

王 晶(1984-)，女，硕士研究生. E-mail:laoer-wangjing@163.com.

张 川. Tel：(021)81871358， E-mail:zhangchuan@smmu.edu.cn.

R92

A

1006-0111(2011)02-0109-03