荧光分光光度法测定水中示踪剂荧光素钠示踪剂

王志龙，樊 萍，徐 静，李博文

（核工业北京地质研究院, 北京100029）

人工示踪技术在水文地质学中的应用已有相当长的历史, 1869 年人类就首次使用了化学示踪剂来找出岩溶区落水洞和泉水之间的水力联系[1]。 在岩溶水文地质研究中, 野外示踪试验是水资源管理、 地下水脆弱性编图和获取水文模型物理参数的一个重要工具,是划分岩溶地下分水岭、 研究岩溶水库渗漏、分析地下管道网络分布和地下水溶质运移特征的一种重要手段[2]。

示踪剂选择原则上要满足以下要求: 极易溶于水, 在水中含量极低； 物理及化学性质稳定, 不与其他环境物质发生物理和化学反应； 易被仪器检测, 不易被水中其他物质干扰, 灵敏度高, 且成本相对较低[3]。 以桂林寨底地下河为例, 分析得出荧光素钠和罗丹明B 在应用中吸附性的差异, 得出荧光素钠是更为理想的示踪剂[4]。 荧光素钠作为示踪剂可以用来研究铀矿地浸溶液的流速[5]。 可以采用分光光度法来测定钻井液中的示踪剂荧光素钠, 其方法检出限为0.005 mg·L-1[6]。

荧光素钠作为示踪剂使用时, 要尽量减少使用的量。 为降低荧光素钠的初始使用浓度, 需要一种检出限更低的方法对荧光素钠进行测定。 而荧光分光光度法具有灵敏度高,选择性好等特点, 因此选择采用荧光分光光度法对水中示踪剂荧光素钠进行定量测定。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

F97XP 荧光分光光度计（上海棱光技术有限公司）； 乙酸钠（AR, 上海阿拉丁试剂有限公司）； 碳酸钠（AR, 上海阿拉丁试剂有限公司）； 邻苯二甲酸氢钾pH 标准试剂（中国计量科学研究院）； 混合磷酸盐pH 标准试剂（中国计量科学研究院）； 硼砂pH 标准溶液试剂（中国计量科学研究院）； 纯水为实验室自制去离子水, 符合GB/T 6682-2008 的要求。

荧光素钠母液的配制: 准确称取0.501 2 g荧光素钠粉末（AR, 上海阿拉丁试剂有限公司）, 用纯水溶解后转移至500 mL 容量瓶中,以纯水定容至刻度后摇匀, 备用。 此溶液含荧光素钠1 002.4 mg·L-1。 荧光素钠标准系列溶液均由该母液稀释得到。

1.2 荧光光度法测定水中示踪剂荧光素钠

1.2.1 最大吸收波长

采用F97XP 荧光光度计, 在增益为7 档（负高压为500 V）的条件下, 对1.0 mg·L-1的荧光素钠溶液在激发波长300～900 nm、 发射波长300～900 nm 范围内进行三维波长扫描,其扫描结果见图1。

图1 荧光素钠三维波长扫描等高图Fig. 1 3D wavelength scanning ascending diagram for fluorescein sodium

由图1 可见, 荧光素钠的最大荧光值处的激发波长为492 nm、 发射波长为513 nm。因此实验选择激发波长492 nm、 发射波长513 nm 作为荧光素钠的测定波长。

1.2.2 溶液pH 值对荧光值的影响

分别用一定体积的邻苯二甲酸氢钾溶液、混合磷酸盐溶液、 硼砂溶液、 乙酸钠溶液和碳酸钠溶液调节浓度为0.40 mg·L-1的荧光素钠溶液的pH 值。 在激发波长为492 nm, 发射波长为513 nm, 激发与发射带宽为5 nm,增益为7 档（负高压500 V）下测定荧光值（以下各项实验的仪器参数均如此设置）, 测定结果见表1。

由表1 可见, 在酸性溶液中荧光素钠的荧光值很低, 而在碱性溶液中荧光值比较平稳, 特别是在pH 值为9.18 的硼砂溶液中荧光值较高, 因此实验选用4.00 mL 的硼砂pH 标准溶液作为酸度调节剂。

1.2.3 不同基体对荧光值的影响

在5 支25 mL 比色管中分别加入1.00 mL 10 mg·L-1的荧光素钠溶液, 并分别以去纯水、自来水、 海水、 地热水和地下水定容至刻度,分别加入4.00 mL 的硼砂pH 标准溶液, 摇匀, 测定荧光值, 结果见表2。

表1 不同pH 值下同一浓度荧光素钠溶液的荧光值Table 1 Fluorescence value of the same concentration of fluorescein sodium solution at different pH

表2 不同基体水样中同一浓度荧光素钠溶液的荧光值Table 2 Fluorescence value of the same concentration of fluorescein sodium solution in different matrix water samples

由表2 可见, 不同基体水样中荧光素钠溶液的荧光值测定相对标准偏差小于1.0%。因此, 不同的基体对荧光素钠溶液荧光值的测定无影响。

1.2.4 标准曲线的绘制

在荧光素钠含量为0～400 μg （浓度0～16 mg·L-1）的范围内测定荧光值, 以荧光素钠含量（μg）为x 轴, 荧光值为y 轴, 绘制曲线,结果见图2。

图2 荧光素钠含量与荧光值的关系Fig. 2 Relationship between fluorescein sodium content and fluorescence value

由图2 可见, 随着荧光素钠浓度增大,其荧光值先增大而后减小。 主要原因是荧光素钠浓度增大时, 其荧光值受自身的荧光淬灭的影响也随之变大。 且在荧光素钠含量为0～40 μg（浓度0～1.6 mg·L-1）范围内, 荧光素钠溶液的荧光值受其自身的荧光淬灭影响较小, 因此在此范围内采用分段的方式进行标准曲线的绘制, 以减小误差。

1.2.4.1 低浓度标准曲线

准 确 移取0.50、 1.00、 2.00、 3.00、 4.00和5.00 mL 浓度为0.10 mg·L-1的荧光素钠标准使用溶液于6 支25 mL 具塞比色管中, 以纯水定容至刻度, 加入4.00 mL 硼砂pH 标准溶液, 摇匀, 测定荧光值, 以荧光素钠含量（μg）为x 轴, 荧光值为y 轴, 绘制标准曲线,结果见图3。 该标准曲线的拟合线性回归方程为y＝11.287 7x＋5.060 7, r＝0.999 9。

图3 低浓度荧光素钠标准曲线Fig. 3 Standard curve of low concentration fluorescein sodium

1.2.4.2 中浓度荧光素钠标准曲线

准 确 移 取0.50、 1.00、 2.00、 3.00、 4.00和5.00 mL 浓度为1.00 mg·L-1的荧光素钠标准使用溶液于6 支25 mL 具塞比色管中, 以纯水定容至刻度, 加入4.00 mL 硼砂pH 标准溶液, 摇匀, 测定荧光值, 以荧光素钠含量（μg）为x 轴,荧光值为y 轴, 绘制标准曲线,结果见图4。 该标准曲线的拟合线性回归方程为y＝10.697 4x＋5.535 0, r＝0.999 9。

图4 中浓度荧光素钠标准曲线Fig. 4 Standard curve of medium concentration fluorescein sodium

根据未知浓度水样的荧光值, 选用合适的上述标准曲线, 将荧光值代入相应标准曲线的拟合线性回归方程中即可计算出样品中荧光素钠的含量, 再除以取样体积就可以得出样品中荧光素钠的浓度。 比较高、 中、 低三条标准曲线的拟合线性回归方程, 可以看出浓度越高, 线性回归方程的截距越大, 斜率越小。 主要还是由于荧光素

1.2.4.3 高浓度荧光素钠标准曲线

准确移取0.50、 1.00、 2.00、 3.00 和4.00 mL 浓度为10.00 mg·L-1的荧光素钠标准使用溶液于5 支25 mL 具塞比色管中, 以纯水定容至刻度, 加入4.00 mL 硼砂pH 标准溶液,摇匀, 测定荧光值, 以荧光素钠含量（μg）为x 轴, 荧光值为y 轴, 绘制标准曲线, 结果见图5。 该标准曲线的拟合线性回归方程为y＝8.310 1x＋23.916 5, r＝0.998 1。钠浓度越大, 其荧光值受自身荧光淬灭影响也越大。

图5 高浓度荧光素钠标准曲线Fig. 5 Standard curve of high concentration fluorescein sodium

1.2.5 精确度实验

分别配制10 份含荧光素钠浓度为0.002 5 mg·L-1的海水、 自来水、 地热水和地下水样品, 分别取25 mL 样品于25 mL 具塞比色管中, 加入4.00 mL 硼砂pH 标准溶液, 摇匀,测定荧光值, 结果见表3。

表3 不同基体中同一浓度荧光素钠测定结果Table 3 Detected results of fluorescein sodium solution with same concentration in different matrix water samples

由表3 可见, 荧光分光光度法测定海水、自来水、 地热水、 地下水中同一浓度（0.002 5 mg·L-1） 的荧光素钠, 其浓度的相对标准偏差分别为0.77%、 1.37%、 1.36%和0.44%, 表明荧光分光光度法测定水中荧光素钠具有良好的精确度。

1.2.6 准确度实验

配制3 份含荧光素钠浓度分别为0.005、0.05 和0.50 mg·L-1的水样, 并在每一份样品中加入一定量的荧光素钠作为加标样。 分别取25 mL 样品于25 mL 具塞比色管中, 加入4.00 mL 硼砂pH 标准溶液, 摇匀, 测定荧光值, 结果见表4。

配制9 份含荧光素钠浓度分别为0.000 1、0.000 2、 0.000 4、 0.001、 0.002、 0.004、0.010、 0.020 和0.040 mg·L-1的水样, 并对这些样品进行测试。 分别取25 mL 样品于25 mL具塞比色管中, 加入4.00 mL 硼砂pH 标准溶液, 摇匀, 测定荧光值, 结果见表5。

由表4 可见, 水中荧光素钠的加标回收率在96.3%～107%之间, 由表5 可知, 当水中荧光素钠的浓度大于0.000 2 mg·L-1时, 其测定浓度与配制浓度的相对偏差均小于20%。因此, 荧光分光光度法测定水中荧光素钠在其浓度值大于等于0.000 2 mg·L-1时具有良好的准确度。

1.2.7 检出限

在某些水质分析方法中, 空白值的测定结果趋近于零, 因而可以用约等于零的标准溶液来进行纯水的代替, 从而进行空白值的测定。 测定20 次以上的空白样品, 空白值的浓度的标准偏差就可以被计算出来, 而这一值的3 倍 就 是需 要 测定 的 方 法 检 出 限[7]。 在HJ/T 168-2004 导则中, 将4 倍检出限浓度定为测定下限。

配制22 份含荧光素钠浓度为0.000 5 mg·L-1的水质样品作为空白加标样品, 分别取25 mL 样品于25 mL 具塞比色管中, 加入4.00 mL硼砂pH 标准溶液, 摇匀, 测定荧光值, 结果见表6。

由表6 可见, 测定空白加标样品浓度的标准偏差为0.000 05 mg·L-1, 则方法检出限为0.000 15 mg·L-1, 测定下限为0.000 6 mg·L-1。

表4 不同浓度荧光素钠样品加标回收测定结果Table 4 Detected results of spiked recovery of fluorescein sodium samples with different concentrations

表5 不同浓度荧光素钠模拟水样测定结果Table 5 Detected results of simulated water samples with different concentrations of fluorescein sodium

表6 空白加标样品测定结果Table 6 Detected results of blank spiked samples

2 结论

通过以上实验表明, pH 值对荧光分光光度法测定水中荧光素钠含量的影响较大, 且用硼砂pH 标准溶液调节水样的pH 效果最佳。在0～1.6 mg·L-1的浓度范围内, 荧光素钠含量与荧光值有良好的线性关系。 由于荧光素钠本身的荧光淬灭现象, 须在0～1.6 mg·L-1浓度范围内采用分段校准方法进行校正, 以减小误差。 该方法的检出限为0.000 15 mg·L-1,测定下限为0.000 6 mg·L-1, 且具有良好的准确度和精密度。 该方法可用于海水、 自来水、 地下水与地热水中荧光素钠含量的测定。