杜氏盐藻鞭毛相关蛋白cDNA片段的克隆及在鞭毛重吸收过程中的表达*

李 靓，石 科，李俊平，柴丹丹，薛乐勋

郑州大学生物工程系细胞生物学研究室郑州 450001

#通讯作者，男，1944年2月生，教授，博士研究生导师，研究方向:肿瘤标志物与基因工程，E-mail:xuelx@zzu.edu.cn

杜氏盐藻鞭毛相关蛋白cDNA片段的克隆及在鞭毛重吸收过程中的表达*

李 靓，石 科，李俊平，柴丹丹，薛乐勋#

郑州大学生物工程系细胞生物学研究室郑州 450001

#通讯作者，男，1944年2月生，教授，博士研究生导师，研究方向:肿瘤标志物与基因工程，E-mail:xuelx@zzu.edu.cn

系列研究简介

薛乐勋教授课题组2000年以来主持承担多项与杜氏盐藻(Dunaliella salina，以下简称盐藻)分子生物学相关的国家及省部级项目，主要包括:国家重点科技攻关项目、国家国际科技合作项目、国家自然科学基金项目(7项)、国家高技术研究发展计划(863)项目、教育部科学技术研究重点项目、教育部高等学校博士学科点专项科研基金项目、河南省重大科技攻关项目、河南省杰出人才创新基金项目、“十·五”及“211工程”重点学科建设项目等。该课题组前期的研究结果显示，通过鞭毛来探讨盐藻的信号转导通路或相关蛋白功能有独特的优点:①盐藻鞭毛伸展于盐藻细胞表面，易于在显微镜下实时动态观察鞭毛表型和功能的变化。②盐藻无细胞壁，对极端环境具有高适应性，培养方法简单，可以通过简单的生化方法来分离鞭毛。③已建立的盐藻转化体系便于进行插入突变，从而用于鞭毛表型突变和功能的研究。④盐藻通常为无性繁殖，基因组呈单倍体，利于进行表型的遗传分析。⑤与衣藻相比，盐藻无细胞壁的细胞结构更接近于哺乳动物细胞。盐藻的这些特点使它成为一个有价值的模式生物。利用分子细胞生物学技术和方法对盐藻鞭毛信号通路转导机制进行研究，将加深对某些疾病复杂发生机制的理解。

该期发表的系列文章为薛乐勋教授课题组近期的研究进展，该系列研究涉及鞭毛/纤毛的结构和功能研究，主要包括:①用反转录PCR及巢式扩增得到了盐藻鞭毛相关蛋白(FAP)的一段cDNA序列，并对该基因在秋水仙碱处理后表达量的变化进行观察，为扩增其cDNA全长并进一步研究该基因在鞭毛重吸收过程中的功能打下基础。②FK506结合蛋白(FKBP)广泛存在于真核及原核生物中，参与调节激素信号转导通路，并在非生物胁迫及其抗逆性中起到重要作用。实验观察了秋水仙碱处理后盐藻FKBP mRNA表达量的变化，指出FKBP与细胞内和鞭毛微管解组装过程有关，这为进一步研究FKBP在鞭毛解组装中的功能提供了依据。③鞭毛驱动蛋白首先是从海胆胚胎获得的，它作为一个正向末端的微管动力蛋白包括两个驱动蛋白亚基FLA10、FLA8和一个非动力结合亚基KAP三个亚单位。作者采用反转录PCR及巢式扩增得到3’RACE和5’RACE的方法扩增盐藻FLA8基因的全长序列及相关信息，为下一步研究FLA8基因在盐藻鞭毛再生过程中的作用以及盐藻FLA8蛋白的纯化与结晶奠定了基础。④藻类驱动蛋白钙调素结合蛋白(KCBP)马达区(KMD)的晶体结构至今未见报道。该研究中构建了盐藻KMD基因原核表达载体，表达纯化了KMD，为解析其晶体结构打下基础。⑤运用酵母双杂交方法研究与stt3a相互作用的蛋白，有利于进一步研究盐藻的耐盐机制和stt3a直接或间接参与盐藻鞭毛再生过程中所需相关蛋白的糖基化修饰，为研究盐藻耐盐机制的分子通路和鞭毛再生的机制提供了实验依据。

课题组目前正在探讨鞭毛相关基因在食管鳞状细胞癌生长、浸润和转移中的作用，以期证实肿瘤发生与纤毛相关的新学说。

杜氏盐藻;鞭毛相关蛋白;秋水仙碱

目的:克隆杜氏盐藻鞭毛相关蛋白(FAP)的cDNA片段并探讨其功能。方法:分析莱茵衣藻等生物的FAP同源蛋白的氨基酸序列保守区域，设计简并引物。提取盐藻总RNA进行RT-PCR。根据得到的序列设计3’RACE引物，巢式PCR扩增该cDNA的3’端序列。秋水仙碱处理对数生长期的盐藻细胞，使细胞停留在分裂中期，并诱导鞭毛缩短，半定量PCR检测FAP基因的表达情况。结果:RT-PCR和3’RACE分别得到长1 535 bp和782 bp的cDNA片段，拼接后总长2 141 bp，编码541个氨基酸。序列比对发现与莱茵衣藻的FAP(88%)、团藻CDC48 (89%)氨基酸序列均有较高的同源性。秋水仙碱处理后盐藻细胞FAP mRNA表达量高于未处理对照组(F组间=43.192，P＜0.001;F时间=2.659，P=0.043;F交互=594.419，P＜0.001)。结论:成功获得杜氏盐藻FAP的cDNA片段，该基因在秋水仙碱诱导的鞭毛重吸收过程中表达量增高。

鞭毛相关蛋白(flagella associated protein，FAP)最早在对莱茵衣藻基因组学研究时被发现，对衣藻鞭毛的蛋白质组学分析显示该蛋白存在于衣藻的鞭毛中［1-2］，但对其功能的研究到目前还未见报道。经BLAST比对莱茵衣藻FAP是AAA(ATPase associated with various cellular activities)超家族成员之一，能利用ATP水解提供能量，与团藻等生物的CDC48具有很高的同源性［3］。CDC48-泛素-蛋白酶体通过降解CDK的抑制因子Farlp而参与酵母有丝分裂G1期起始点的控制［4］。在哺乳动物细胞中，CDC48的同源物VCP在泛素化所介导的蛋白质降解途径中发挥重要作用［5］。研究［6］发现拟南芥的CDC48在细胞的分裂过程中定位在细胞板处，推测该蛋白可能参与新细胞壁的形成。杜氏盐藻是一种低等的单细胞绿色藻类，无细胞壁，有一对等长的鞭毛。其生长周期短，培养条件简单，可作为研究鞭毛的有力工具［7］。作者设计简并引物以及3’RACE引物，用反转录PCR及巢式扩增得到了杜氏盐藻FAP的一段cDNA序列，并对秋水仙碱处理后表达量的变化进行了追踪［8-9］，为扩增其cDNA全长并进一步探索该基因的功能提供了帮助。

1 材料与方法

1.1 实验材料及试剂 杜氏盐藻UTEX-LB-1644购自美国得克萨斯大学，大肠杆菌DH5α为实验室保存，Trizol购自Invitrogen公司，反转录试剂盒购自FERMENTAS公司，First Choice RLM-RACE Kit购自Ambion公司，LA Taq DNA聚合酶、EcoRⅠ、HindⅢ等DNA限制性内切酶、pMD19-T载体、凝胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒均购自大连宝生物工程公司(TaKaRa)。

1.2 杜氏盐藻FAP cDNA片段的扩增

1.2.1 杜氏盐藻总RNA的提取及cDNA制备 将杜氏盐藻细胞接种于UTEX液体培养基中(5×105mL－1)，以26℃、光暗各12 h的条件培养至对数生长期。取盐藻细胞，用Trizol法提取其总RNA，10 g/L琼脂糖凝胶电泳及A(260 nm)/A(280 nm)检测RNA的质量和浓度。按照反转录试剂盒说明书进行反转录，得到的 cDNA第一链于 －20℃保存待用。

1.2.2 简并引物的设计 在GenBank中搜索莱茵衣藻FAP，团藻、小球藻等的CDC48氨基酸序列，比对分析找到两段保守性较高的序列设计简并引物。上游引物:5’-TA(C/T)GA(A/G)TT(C/T)GT(A/ G/C/T)GT(A/G/T/C)-3’，下游引物:5’-(A/G/C/ T)AC(A/G)AA(C/T)TC(A/G)TC(A/G)TC-3’，产物大小1 535 bp，引物由博尚生物技术有限公司合成。

1.2.3 PCR扩增 以制备的杜氏盐藻cDNA第一链为模板，用合成的简并引物扩增。PCR体系:模板1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL，dNTP (10 mmol/L)8 μL，10×LA Buffer 10 μL，LA Taq 0.5 μL，H2O 76.5 μL，共100 μL。PCR反应条件: 94℃4 min;94℃30 s，55～65℃30 s，72℃3 min，30个循环;72℃10 min，4℃终止。

1.2.4 序列分析 PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳，所得条带胶回收后与pMD19-T连接(PMD19-T-FAP)并转化至大肠杆菌DH5α，蓝白斑筛选，挑取阳性克隆扩大培养，提取质粒，EcoRⅠ、HindⅢ双酶切鉴定插入片段大小正确后将菌液送华大基因生物技术有限公司测序。测序结果用BLAST进行同源性分析。

1.3 杜氏盐藻FAP cDNA的3’端扩增 根据得到的已知序列用Primer Premier 5.0设计3’RACE引物。外侧引物:5’-GCTCATCTACATTCCTCTGC CCDC-3’，内测引物:5’-CGTGAGCGACGCAGA CATCC-3’，产物大小 782 bp。提取杜氏盐藻总RNA，按照First Choice RLM-RACE Kit说明书反转录成cDNA作为3’RACE模板。巢式PCR扩增FAP cDNA的3’端序列，PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶检测，回收后与pMD19-T载体连接(pMD19-TFAP)并转化至大肠杆菌 DH5α，阳性克隆扩大培养，提取质粒，EcoRⅠ、HindⅢ双酶切鉴定后送华大基因生物技术有限公司测序，将测序结果与RTPCR序列拼接。

1.4 秋水仙素处理后杜氏盐藻FAP基因的表达情况分析 用Primer Premier 5.0在所得到的FAP cDNA片段中设计一对特异性引物，并同时设计GAPDH基因特异性引物如下。上游引物:5’-GCCAAC GAGTGCCAGTCAAA-3’，下游引物:5’-TGTTCAT GCCGTCCATCTCT-3’。GAPDH上游引物:5’-CAAGTTCTCCGCCCGATGTGA-3’，GAPDH下游引物:5’-GAACACGCCTGTGCCCTCAA-3’。接种杜氏盐藻培养至对数生长期，离心收集盐藻细胞重悬于相同的UTEX培养基中并平均分成实验组和对照组，实验组加入秋水仙碱至终浓度为0.189 μmol/ L，对照组不作处理。分别在处理后0、30、60、90、120及150 min取样离心，收集沉淀后加Trizol于－80℃冰箱中保存。将取得的样品分别用Trizol法提取总RNA，反转录得cDNA，用以上合成的引物进行PCR，以GAPDH作为内参。PCR体系:cDNA 0.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，dNTP 4 μL，LA Buffer 5 μL，LA Taq 0.25 μL，H2O 39.75 μL，共50 μL。PCR反应条件:94℃4 min;94℃30 s，60℃ 30 s，72℃30 s，30个循环;72℃10 min，4℃终止。PCR产物用20 g/L琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.5 统计学处理 应用SPSS 17.0进行数据处理，秋水仙碱处理后，2组FAP mRNA表达水平的比较采用2×6析因设计的方差分析，检验水准 α= 0.05。

2 结果

2.1 杜氏盐藻FAP cDNA片段分析结果

2.1.1 杜氏盐藻总RNA质量鉴定 琼脂糖凝胶电泳显示28S和18S亮度比例约为2∶1，无拖尾现象，所提RNA完整性较好，A(260 nm)/A(280 nm)介于1.8～2.0，无DNA和蛋白质污染，可用于下一步实验。

2.1.2 FAP cDNA片段扩增产物鉴定结果 电泳结果显示PCR产物片段长度约1 500 bp，与推测值1 535 bp相符。胶回收后连接于pMD19-T载体上，转化筛选后双酶切产物电泳结果见图1。

2.1.3 3’RACE产物鉴定结果 3’RACE产物电泳后得到一条大于800 bp左右的条带，胶回收后与pMD19-T载体连接，质粒经双酶切鉴定，结果见图2。

2.1.4 FAP cDNA序列分析结果 拼接后所得到的FAP cDNA片段总长2 141 bp，其中开放阅读框1 626 bp，编码541个氨基酸，3’非翻译区515 bp。所编码的氨基酸序列经比对与莱茵衣藻、团藻相应序列的同源性分别为88%和89%。

2.2 秋水仙碱处理后杜氏盐藻FAP基因的表达情况分析 RT-PCR产物电泳结果见图3。秋水仙素处理后杜氏盐藻FAP基因表达量明显高于对照组，见表1。

图3 秋水仙碱处理后杜氏盐藻FAP基因的表达

表1 秋水仙碱处理后FAP基因表达情况灰度分析

3 讨论

所得到的杜氏盐藻FAP的氨基酸序列与莱茵衣藻的FAP、团藻的CDC48都有较高的同源性，预测含有AAA结构域，其中有ATP结合位点，能利用ATP水解提供的能量［3，10］，Walker A基序形成一个能结合核苷酸α和β磷酸基的环，Walker B基序包含4个脂肪族氨基酸和两个带负电荷的氨基酸，对Mg2+的结合至关重要，精氨酸指是AAA家族的特异基序，能感受ATP的结合将其水解并传递构象改变。

CDC48能与Ufd1和NpL4形成复合体，该复合体将泛素化的待降解蛋白运输到26S蛋白酶体［11］。对CDC48功能的研究主要侧重于其在细胞有丝分裂起始控制、内质网相关蛋白降解以及植物细胞有丝分裂末期细胞壁形成中的作用，这些过程大多已证实与泛素化蛋白质的降解相关［3-5］。研究发现，莱茵衣藻的鞭毛中存在游离的泛素和泛素化的蛋白质，在鞭毛重吸收过程中，鞭毛中泛素化蛋白大量增加，并因此推测，在莱茵衣藻的鞭毛中存在一个泛素结合系统。而莱茵衣藻鞭毛蛋白质组学的分析结果显示FAP存在于衣藻的鞭毛中［2］。秋水仙碱能够破坏纺锤体，并能引起杜氏盐藻发生鞭毛重吸收［9］。作者发现，FAP在秋水仙碱处理后的盐藻细胞中表达量增加明显，因此推测，FAP可能参与了盐藻细胞鞭毛重吸收过程中细胞骨架蛋白及相关鞭毛组成蛋白的降解过程。然而，目前仅知道该蛋白在鞭毛中存在，是否在细胞的其他部位也有分布尚不清楚，对该蛋白在杜氏盐藻细胞中进行定位非常必要。FAP是否参与了细胞骨架蛋白及鞭毛组成蛋白的降解尚需实验证实，该蛋白的功能有待进一步研究。

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Cloning and expression of flagella associated protein cDNA fragment from Dunaliella salina and its expression during flagellar reabsorption

LI Liang，SHI Ke，LI Junping，CHAI Dandan，XUE LexunLaboratory for Cell Biology，Department of Bioengineering，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001

Dunaliella salina;flagella associated protein;colchicine

Aim:To clone flagella associated protein(FAP)cDNA fragment from Dunaliella salina and investigate its function.Methods:RT-PCR was carried out with degenerated primers designed according to the conserved amino acid sequences of Chlamydomonas reinhardtii，Volvox carteri f.nagariensis and other organisms.3’RACE was performed with specific primer designed based on the sequence obtained by RT-PCR.The transcription level of FAP gene of Dunaliella salina cells treated with colchicine was detected by RT-PCR using GAPDH as control.Results:A cDNA sequence of 1 535 bp and a 3’end sequence of 782 bp were obtained respectively，and an assembled sequence of the two sequences encoded a polypeptide predicted to be composed of 541 amino acids.The deduced amino acid sequence shared high homology with Chlamydomonas reinhardtii(88%)and Volvox carteri f.nagariensis(89%).Additionally，the expression of FAP mRNA in Dunaliella salina treated with colchicine was significantly higher than the untreated group(Fgroup=43.192，P＜0.001; Ftime=2.659，P=0.043;Finteraction=594.419，P＜0.001).Conclusion:The cDNA fragment of FAP from Dunaliella salina has been obtained successfully，and its expression increases during the flagellar reabsorption induced by colchicine.

Q781

*国家自然科学基金资助项目 30700014;科技部国际科技合作基金资助项目 2007DFA01240

(2011-03-30收稿 责任编辑王 曼)