莱茵衣藻CrDRBs基因的克隆和生物信息学分析

娄素琳，林 鑫，黄思敏，李 辉,4，胡章立,4

1) 深圳大学生命与海洋科学学院，深圳市海洋生物资源与生态环境重点实验室，广东深圳 518060；2) 深圳大学光电工程学院，光电子器件与系统教育部/广东省重点实验室，广东深圳 518060；3) 广东省植物表观遗传学重点实验室，广东深圳 518060；4) 深圳大学龙华生物产业创新研究院，深圳市海洋藻类生物工程技术研究中心，广东深圳 518060

双链小核糖核酸(micro ribonucleic acid, microRNA 或miRNA)结合蛋白(double-stranded RNA-binding protein, DRB)是一类广泛存在于真核细胞、细菌和病毒中，含有双链RNA结合结构域(dsRNA-binding domain，dsRBD)的蛋白．dsRBD 结构域一般由约70个氨基酸残基组成，具有一定种属保守性，dsRBD的结构为αβββα折叠[1-4]．DRB在miRNA的生物合成途径中与核酸酶Dicer协同作用，共同精确剪切前体而生成成熟miRNA[5-6]．研究表明，DRB在miRNA选择何种作用方式中也起着重要作用[7-8]．

在动植物中，一般存在多个DRB蛋白成员，且每个DRB在miRNA途径的分工略有不同[9-11]．拟南芥DRB蛋白家族共有5个成员DRB1～DRB5，其中， 研究最透彻的是DRB1(即HYPONASTIC LEAVES1，HYL1)．多项研究表明，在拟南芥miRNA 调控途径中，DRB1作为DCL1的重要互作因子，可共同作用、精确有效地从初级转录本剪切生成miRNA，并把其带至AGO1催化的RNA诱导沉默复合物RISC[12-13]，执行剪切靶基因mRNA序列或抑制翻译的作用．拟南芥DRB1参与miRNA介导的靶mRNA剪切，且是剪切所必需的，然而DRB2是miRNA介导的翻译抑制所必需的[14]．此外，DRB2也是DCL1的互作蛋白，DRB2还抑制DRB1的表达．通过对突变体drb1和drb2蛋白组学的研究，表明DRB1参与的miRNA调控mRNA剪切，广泛存在于各个代谢过程，包括合成代谢和分解代谢，尤其脂肪酸降解途径[14]．反之，DRB2相关的翻译抑制显得不太普遍，只是特异性地响应生物或非生物胁迫．

拟南芥DRB1和DRB2均含有两个dsRBD结构域，DRB1的dsRBD结构域和苔藓有50%同源性，而DRB2的dsRBD结构域在两者中有80%同源性，DRB2比DRB1更加保守．文献[6]研究认为，DRB1和DRB2之所以分工不同，主要是蛋白结构域的差异．DRB1的氨基酸序列和DRB2非常不同，分析drb1的转基因株系揭示了DRB1和DRB2的第1个dsRBD结构域在功能上类似，而第2个dsRBD结构域在功能上明显不同，生物信息分析表明DRB2的C-末端结构域在miRNA途径中起功能作用，而DRB1在该位置的结构域是非必须的．

miRNAs调控途径在高等多细胞真核生物已得到广泛深入的研究，但对低等单细胞真核生物的研究非常少[15]．莱茵衣藻是一种重要的单细胞模式微藻，同时也是一种极具经济价值的能源微藻．而miRNAs作为一类重要的转录后调控因子，虽然在莱茵衣藻中的研究起步略晚，但其重要地位不容小觑．所在课题组近年对莱茵衣藻miRNAs的研究取得了一系列成果，不仅在莱茵衣藻中发现了一些新的miRNAs存在，且还发现miRNAs在莱茵衣藻缺硫产氢过程中的重要调控作用[16-17]．目前莱茵衣藻miRNA作用机制的研究非常少，关于莱茵衣藻CrDRB蛋白在miRNA途径作用的研究更少．2016年底首次报道了莱茵衣藻的DRB蛋白(DUS16)，证明了DUS16在pri-miRNA的加工过程起着重要作用，发现DUS16蛋白定位在细胞核和细胞质，且与CrDCL3相互作用[18-19]．本研究拟挖掘莱茵衣藻所有DRB蛋白，并对其进行生物信息学分析，为下一步全面揭示莱茵衣藻CrDRB的功能，及其在miRNA调控途径的不同分工奠定基础．

1 实验方法

1.1 莱茵衣藻藻株及培养条件

莱茵衣藻藻株 cc849 购自莱茵衣藻资源中心(https://www.chlamycollection.org/)．衣藻在TAP培养基培养至对数生长期，离心收集藻细胞用于总RNA的提取．

1.2 总RNA的提取

① 收集藻体后用液氮研磨成粉末，转至1.5 mL离心管中(粉末不超过管身一半)，加入1 mL Trizol抽提液，充分摇匀，漩涡振荡10 min；② 加200 μL氯仿，混匀5 min，室温放置15 min，于10 ℃以下，12 000 r/min离心15 min；③ 吸取上清于另一灭菌的离心管中(上清约600 μL)，加入400 μL预冷的异丙醇，-20 ℃沉淀1～2 h，或于-70 ℃沉淀10 min，然后12 000 r/min离心10 min；④ 倒掉上清，保留沉淀，加入1 mL体积分数为75%乙醇(焦碳酸二乙酯，diethyl pyrocarbonate，DEPC)，轻弹使沉淀悬起，7 500 r/min离心5 min，倒掉上清，再重复1次；⑤ 室温风干RNA，加入20～30 μL DEPC处理水溶解，-70 ℃下保存备用．

1.3 cDNA的获得

反转录具体步骤参照Promega M-MLV反转录试剂盒说明书，略有改动．① 取5 μL RNA，加5 μL 浓度为10 μmol/L的引物Oligo (dT)20，混匀，70 ℃反应5 min，打开RNA的二级结构，立即置于冰上5 min；② 往上述反应液加入5 μL 5×M-MLV缓冲液、1.25 μL浓度为10 mmol/L的dNTP 混合物、1 μL M-MLV 反转录酶和7.5 μL DEPC处理水，混匀，25 ℃反应5 min，然后42 ℃反应1 h，最后置于70 ℃孵育10 min使酶失活；③ cDNA产物-20 ℃保存．所得的反转录产物可直接作为聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)的模板．

1.4 实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR，qRT-PCR)是应用SYBR Premix Ex TagTMⅡ试剂盒(Takara)的反应体系，按说明书操作．PCR反应条件为：95 ℃ 3 min，1个循环；95 ℃ 10 s，58 ℃ 15 s (取决于不同引物的Tm值)，72 ℃ 20 s，共45个循环．在65～95 ℃，每0.5 s读取荧光强度分析熔解曲线．每个样品重复3次．实时荧光定量PCR检测的数据采用相对定量的二阶导数法分析(2-△△Ct)．

△△Ct=Ctsample-Ctactin

(1)

其中，Ctsample和Ctactin分别是目的基因和内参基因actin的Ct值，Ct为荧光阈值．

1.5 进化树构建

从Phytozome数据库(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)下载莱茵衣藻和拟南芥的所有 DRB 基因序列，在美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)数据库预测DRB的dsRBD结构域，并获取其序列，使用 MUSCLE软件对所有 dsRBD 序列进行对位排列，利用 MEGA7.0 软件构建邻接法(neighbor joining)系统进化树．

2 结果与分析

2.1 莱茵衣藻CrDRB的dsRBD结构域位置

从Phytozome 数据库下载莱茵衣藻的全基因组序列，从蛋白质功能结构域 Pfam 数据库中下载DRB基因的结构域模块PFAM00035，使用 HMMER 软件基于 DRB 结构域检索莱茵衣藻全基因组，获得莱茵衣藻中所有含 dsRBD 结构域的 DRB 蛋白共4个，其中，1个为已经报道的DUS16(Cre05.g232004.t1.1)[18-19]．将另外3个DRB蛋白分别命名为CrDRB1(Cre06.g280500.t1.1)、CrDRB2(Cre13.g574650.t1.1)和CrDRB3 (Cre03.g199550.t1.2)． 莱茵衣藻的4个DRB蛋白大小为518～2 037个氨基酸残基不等，dsRBD结构域在蛋白的位置如图1．

图1 莱茵衣藻CrDRB蛋白的dsRBD结构域位置Fig.1 The location of dsRBD domain of Chlamydomonas CrDRB

2.2 莱茵衣藻CrDRB基因的克隆

根据Phytozome 数据库中莱茵衣藻4个CrDRBs基因的cDNA编码区序列，设计引物，PCR分别扩增4个基因，产物电泳结果如图2，条带大小均符合预期，即DUS16为1 557碱基对(base pair，bp)，CrDRB1为6 042 bp，CrDRB2为2 355 bp，CrDRB3为4 251 bp．

图2 PCR检测莱茵衣藻4个CrDRBs基因Fig.2 PCR detection of four CrDRBs genes in Chlamydomonas

2.3 莱茵衣藻CrDRB基因的表达分析

为分析比较莱茵衣藻中4个CrDRBs基因的mRNA表达水平．收集对数生长期的衣藻细胞，提取mRNA，反转录获得cDNA．每个CrDRBs基因设计3～4对qRT-PCR引物，测试之后选取一对溶解曲线最佳，特异性最好的引物做后续基因表达分析．以actin基因为内参基因，DUS16与actin的表达量比值设为1，其他几个基因的相对表达量分别如图3所示．由图3可见，基因CrDRB3和CrDRB1的相对表达水平显著高于已报道的DUS16[18]， 而CrDRB2的相对表达水平则显著低于DUS16．

图3 qRT-PCR分析莱茵衣藻4个CrDRBs基因的相对表达水平Fig.3 qRT-PCR analysis of the relative expression of four CrDRBs in Chlamydomonas

2.4 莱茵衣藻CrDRBs蛋白的dsRBD结构域分析

通过NCBI的Protein Blast及结构域的预测分析，获取莱茵衣藻4个CrDRBs蛋白的dsRBD序列，分别将该4段序列通过软件Phyre2在线预测二级结构，方法参考文献[20]．莱茵衣藻4个CrDRBs蛋白的dsRBD结构域如图4，CrDRB1、CrDRB3和DUS16蛋白的dsRBD结构域均可形成αβββα的拓扑结构，这是DRB蛋白特有的结构．但是CrDRB2蛋白的dsRBD结构域中β折叠不明显．

图4 莱茵衣藻4个CrDRBs蛋白的dsRBD结构域Fig.4 dsRBD domain of four CrDRBs in Chlamydomonas

2.5 同源比对分析莱茵衣藻各个CrDRBs基因序列

将莱茵衣藻4个CrDRBs的dsRBD序列，通过BioEdit软件的ClustalW multiple alignment多列比对分析(图5)．结果发现，4个dsRBD序列有一定的同源性，其中有3个保守的氨基酸，分别是1个亮氨酸L和2个甘氨酸G，均处于N端．

2.6 莱茵衣藻和拟南芥dsRBD的进化分析

拟南芥中5个DRBs蛋白在miRNA途径的作用有明确分工，为探究莱茵衣藻中4个CrDRBs在miRNA途径可能的功能，及其与拟南芥的异同．将莱茵衣藻CrDRBs的dsRBD结构域与拟南芥5个DRBs成员的10个dsRBD结构域(每个拟南芥DRB均有两个dsRBDs)构建系统进化树(图6)．从进化树的结果看出，大致分为了莱茵衣藻CrDRBs与拟南芥DRBs两大簇，其中，莱茵衣藻CrDRB2与DUS16在进化上较相近，而CrDRB3与其他衣藻CrDRBs较远．

图5 莱茵衣藻CrDRBs蛋白dsRBD结构域同源性比较Fig.5 Sequence alignment of dsRBD domain of CrDRBs in Chlamydomonas

图6 莱茵衣藻与拟南芥dsRBD结构域的进化分析Fig.6 Phylogenetic analysis of dsRBD domain in Chlamydomonas and Arabidopsis

3 讨 论

DRB是一类含有dsRBD的蛋白，除参与RNA的加工和翻译调控外，另一重要功能是，在miRNA的生物合成和作用方式选择方面起着重要作用[21]．一般情况，拟南芥或其他高等植物的DRB蛋白大多具有两个或以上的dsRBD结构域，但从图1结果看出，莱茵衣藻的4个CrDRBs蛋白均只有1个dsRBD结构域．造成这种差异的原因可能是莱茵衣藻属于低等生物，在由低等生物到高等植物的进化过程中，dsRBD由1个拷贝演变到多个拷贝．同源比对分析莱茵衣藻4个CrDRBs蛋白的dsRBD结构域，发现相似性不是特别高，有3个氨基酸是保守的．然而，拟南芥DRB成员的dsRBD同源性高达90%．究其原因可能是dsRBD结构域在不同物种之间，尤其是在高等植物和低等微藻之间的差异较大．此外，发现莱茵衣藻CrDRB2的dsRBD结构域不具有典型的完整αβββα拓扑结构，对此下一步将通过RNA结合实验来确定CrDRB2是否为双链RNA结合蛋白．

从文献[9]可知拟南芥的5个DRB蛋白均小于500个氨基酸，最大的DRB2为434个氨基酸．但从图1和2可见，莱茵衣藻的CrDRB蛋白普遍较大，CrDRB1为2 037个氨基酸，CrDRB3为1 416个氨基酸，最小的DUS16为518个氨基酸．莱茵衣藻CrDRBs不仅蛋白较大，且GC含量也较高，导致基因的克隆和蛋白的表达难度也增加了．拟南芥5个DRB蛋白的功能已经很明确，其在miRNA途径的分工也很清晰．但在莱茵衣藻中，目前只有DUS16有相关报道，DUS16与CrDCL3相互作用，共同参与pri-miRNA的剪切．莱茵衣藻其他3个CrDRBs是否也参与了miRNA途径，目前尚不清楚，它们是否参与决定miRNA剪切或抑制翻译的调控方式也尚待进一步研究．

利用qRT-PCR分析莱茵衣藻CrDRBs的基因表达水平，CrDRB3的相对表达量最高，是DUS16的2倍多；CrDRB1的表达水平也较高，约为DUS16的1.5倍；CrDRB2的相对表达量最低．由此说明在莱茵衣藻对数生长时期，CrDRB3 和CrDRB1基因相对较活跃，可能参与了多个生物学过程．

综上可见，DRB是一类双链RNA结合蛋白，在miRNA调控过程起着重要作用．本研究获得莱茵衣藻中4个含 dsRBD 结构域的 CrDRBs 蛋白相关信息，其中包括已经报道的RNA结合蛋白DUS16．分析4个CrDRBs基因的表达情况，发现CrDRB3和CrDRB1的相对表达较高．预测4个CrDRBs的dsRBD二级结构，发现除CrDRB2之外，其他3个CrDRBs蛋白均可形成DRB蛋白特有的αβββα拓扑结构．将莱茵衣藻CrDRBs的dsRBD与拟南芥的5个DRB成员构建系统进化树分析，初步探讨分析莱茵衣藻CrDRBs各成员的的进化保守性．为下一步全面揭示莱茵衣藻CrDRB蛋白功能，及其在miRNA调控途径的具体分工奠定了基础．