非小细胞肺癌组织中CD68与c-Jun蛋白的表达*

刘 瑜，王 娜，冯斐斐，燕 贞，王 威，张少锋，秦丽娟，吴逸明

郑州大学公共卫生学院劳动卫生学教研室郑州 450001

#通讯作者，男，1944年11月生，教授，研究方向:分子肿瘤学，E-mail:wuym@zzu.edu.cn

非小细胞肺癌组织中CD68与c-Jun蛋白的表达*

刘 瑜，王 娜，冯斐斐，燕 贞，王 威，张少锋，秦丽娟，吴逸明#

郑州大学公共卫生学院劳动卫生学教研室郑州 450001

#通讯作者，男，1944年11月生，教授，研究方向:分子肿瘤学，E-mail:wuym@zzu.edu.cn

CD68;巨噬细胞;c-Jun;非小细胞肺癌;慢性炎症

目的:探讨非小细胞肺癌(NSCLC)组织中CD68和c-Jun蛋白的表达与肺癌发生发展的关系及其意义。方法:采用免疫组化SP法检测67例人NSCLC标本(每个标本取癌、癌旁和正常组织)中CD68和c-Jun蛋白的表达，应用Spearman秩相关检验CD68阳性细胞数与c-Jun蛋白表达的相关性。结果:肺癌、癌旁及正常肺组织中CD68阳性细胞数依次为11.8±1.4、97.5±2.5和52.1±1.9，差异有统计学意义(F=52 334.934，P＜0.001);c-Jun蛋白的平均光密度值依次为0.25±0.03、0.23±0.02和0.20±0.01，差异有统计学意义(F=91.280，P＜0.001)。癌旁组织中CD68阳性细胞数与年龄、性别、病理类型、分化程度、吸烟无关(P＞0.05)，与TNM分期(F= 158.273，P＜0.001)、淋巴结转移(F=84.985，P＜0.001)、是否侵及胸膜(F=16.422，P＜0.001)有关。癌旁组织中c-Jun蛋白的表达与年龄、性别、病理类型、吸烟无关(P＞0.05)，与TNM分期(F=19.319，P＜0.001)、分化程度(F=33.918，P＜0.001)、淋巴结转移(t=12.155，P＜0.001)、是否侵及胸膜(F=8.318，P=0.005)有关。在癌旁组织中CD68阳性细胞数与c-Jun蛋白的表达呈正相关(rs=0.519，P＜0.001)。结论:巨噬细胞主要浸润在癌旁组织中，可能通过激活蛋白-1促进NSCLC的发展转移。

有报道［1-2］，多种恶性肿瘤发生或进展与炎症有关，而单核-巨噬细胞浸润是炎症发生发展过程中至关重要的环节，单核-巨噬细胞分泌的多种前致炎因子是炎症微环境中不可替代的主要组成成分。激活蛋白-1(activator protein 1，AP-1)被认为是“早期即刻基因”和“早期反应原癌基因”，直接参与外界各种毒性及致癌性刺激引发的细胞内信号传导，调节与细胞增生、分化、转化、凋亡、肺部防御、炎症以及免疫反应等有关的基因表达［3］。目前国内外对肿瘤相关巨噬细胞(tumor association macrophage，TAM)和AP-1均有研究，但是将两者联合考虑的相关报道较少，因此作者通过检测非小细胞肺癌(nonsmall cell lung cancer，NSCLC)患者的肺癌组织、癌旁组织以及正常组织中巨噬细胞表面标志CD68和AP-1亚家族c-Jun的表达来探讨它们与肺癌发生发展的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 67例NSCLC来自郑州大学第一附属医院2008年1月至2009年12月手术切除标本，所有病例术前均无化疗、放疗及免疫治疗史，术后均经病理证实。其中男35例，女32例，年龄30～78岁，中位年龄58岁。依据2004年WHO肺癌的分类标准:鳞癌29例，腺癌38例;高分化21例，中分化29例，低分化17例。临床分期按国际抗癌联盟(UICC 2009版)分期标准:Ⅰ期29例，Ⅱ期13例，Ⅲ期17例，Ⅳ期8例;伴淋巴结转移26例，无淋巴结转移41例;侵及胸膜31例，未侵及胸膜36例;有吸烟史37例，无吸烟史30例。全部标本分别在癌组织、癌旁组织以及正常组织(经病理学证实)处取材，福尔马林固定，常规脱水，石蜡包埋，每个蜡块连续切片6张，切片厚度4 μm。

1.2 c-Jun和CD68蛋白的检测 采用免疫组化SP法，兔抗人c-Jun多克隆抗体、SP免疫组化试剂盒和DAB显色剂购于北京中杉金桥生物技术开发公司，鼠抗人CD68单克隆抗体购于Santa Cruz公司。每个指标使用3张切片重复实验，染色程序严格按试剂盒说明书进行，c-Jun和CD68一抗分别按1∶50和1∶10稀释，每批次染色均用PBS代替一抗作空白对照，DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，封片。应用江苏捷达科技公司图像采集分析系统，在高倍镜下每张切片选取阳性细胞集中的10个视野采集图像。CD68采用阳性细胞计数法，即计数10个高倍视野下阳性细胞数，求平均值。c-Jun则采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件，测量每个视野下阳性表达区域的累积光密度。

1.3 统计学处理 采用SPSS 12.0进行分析，应用重复测量数据的方差分析和 SNK法比较各组间CD68和c-Jun蛋白表达的差异，应用单因素方差分析比较不同临床病理特征癌旁组织中CD68和c-Jun蛋白表达的差异，应用Spearman秩相关分析癌旁组织中CD68阳性细胞数量和c-Jun蛋白表达的相关性，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 肺癌、癌旁及正常组织中CD68和c-Jun的表达 见图1、表1。CD68蛋白主要表达于细胞质中，染色呈棕黄(褐)色，阳性细胞多弥散分布在癌巢周围间质及癌旁组织中，正常组织中也有明显表达，在癌巢中表达较少。c-Jun蛋白主要表达于细胞质或细胞核，染色呈棕褐(黄)色，癌组织中多为巢状细胞着色，癌旁组织中呈片状表达，在正常组织中散在分布。

2.2 癌旁组织中CD68和c-Jun的表达与肺癌临床病理特征的关系 见表2。

表1 NSCLC组织、癌旁组织和正常肺组织中CD68和c-Jun的表达(n=67)

图1 肺癌、癌旁和正常组织中CD68(A)和c-Jun(B)蛋白的表达(SP，×400)

表2 癌旁组织中CD68和c-Jun蛋白表达与NSCLC患者临床病理特征的关系

2.3 癌旁组织中CD68阳性细胞数和c-Jun蛋白表达之间的相关性 癌旁组织中CD68阳性细胞数和 c-Jun蛋白表达呈正相关(rs=0.519，P＜0.001)。

3 讨论

许多研究［4-8］表明:在多种鼠类和人类恶性肿瘤中，包括乳癌、前列腺癌、神经胶质瘤及淋巴瘤等，巨噬细胞的数量或密度增加与不良预后有着绝对的关联性。CD68是一种相对分子质量为110 000的跨膜糖蛋白，在人组织巨噬细胞中高表达，可以作为组织中巨噬细胞的标志。该研究结果显示，CD68阳性细胞主要在癌旁组织中表达，晚期(Ⅲ、Ⅳ期)肿瘤患者癌旁组织中CD68阳性细胞的数量要高于早期(Ⅰ、Ⅱ期)，并且与淋巴结转移以及侵及胸膜有关，提示肿瘤周围浸润CD68阳性细胞的数量与NSCLC的发展和转移密切相关。另外，作者发现肿瘤周围正常组织中也呈现CD68高表达，说明癌灶周围的正常组织已经存在炎性浸润，这与Mantovani等［9］的观点相符，即肿瘤的存在能够不断地募集附近血管中的巨噬细胞向其靠近，形成利于其发展转移的肿瘤微环境。Sica等［5］认为肿瘤在形成过程中能诱导巨噬细胞发生表型和功能改变，使其转化为M2型巨噬细胞，帮助肿瘤逃避免疫监视，促进肿瘤的侵袭和转移。Lin等［10］认为，肿瘤的生长和发生恶性变是两个分开的过程，巨噬细胞被募集至癌前病变部位，启动血管生成，预示恶性转变开始，减少这些巨噬细胞的浸润能够减少50%以上血管密度甚至阻止肿瘤发展到晚期。

转录因子AP-1是亮氨酸拉链蛋白，在哺乳动物中AP-1二聚体主要由Jun和Fos蛋白亚家族组成，Jun蛋白家族包括Jun、Jun-B及Jun-D;Fos蛋白家族成员为Fos、FosB、Fra-1及Fra-2。Jun蛋白可以形成同源二聚体，亦可与Fos或Fras形成更加稳定的异源二聚体，而Fos则只能与Jun形成异源二聚体，故可以用c-Jun蛋白的表达量来反映AP-1的表达［11］。该研究结果显示癌组织中c-Jun的表达高于癌旁组织和正常组织，提示肿瘤的发生与AP-1/c-Jun的活化有关;晚期肿瘤患者癌旁组织中c-Jun表达高于早期，低分化肿瘤组织中的表达高于高、中分化肿瘤，提示AP-1/c-Jun随着肿瘤的发展和恶性程度的增加而增强活化;在伴有淋巴结转移或者侵及胸膜的肿瘤中高表达，提示AP-1/c-Jun与肿瘤的远端转移密切相关，这与Tichelaar等［12］从体外实验得出的结论一致。Hess等［13］认为c-Jun的表达上调能够促进MMPs、u-PA等的分泌，进一步促进肿瘤的侵袭和转移。

该研究结果显示，在癌旁组织中CD68阳性细胞数与c-Jun蛋白的表达呈正相关，提示癌旁组织中巨噬细胞浸润可能与c-Jun的表达上调有关，由此推测TAM可能是通过激活AP-1/c-Jun来促进NSCLC的发展转移，与Hagemann等［14］的体外实验结论相符。该研究为进一步探讨炎症促进NSCLC发生发展的机制提供了重要的线索。

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［12］Tichelaar JW，Yan Y，Tan Q，et al.A dominant-negative cjun mutant inhibits lung carcinogenesis in mice［J］.Cancer Prev Res(Phila)，2010，3(9):1148

［13］Hess J，Angel P，Schorpp-Kistner M.AP-1 subunits: quarrel and harmony among siblings［J］.J Cell Sci，2004，117(Pt25):5965

［14］Hagemann T，Wilson J，Kulbe H，et al.Macrophages induce invasiveness of epithelial cancer cells via NF-κB and JNK［J］.J Immunol，2005，175(2):1197

Expressions of CD68 and c-Jun proteins in non-small cell lung cancer tissue

LIU Yu，WANG Na，FENG Feifei，YAN Zhen，WANG Wei，ZHANG Shaofeng，QIN Lijuan，WU Yiming

Department of Occupational Health，college of Public Health，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001

CD68;macrophage;c-Jun;non-small cell lung cancer;chronic inflammation

Aim:To explore the expressions of CD68 and c-Jun proteins in non-small cell lung cancer(NSCLC)，and their relationship with the development of lung cancer.Methods:Immunohistochemical SP method was used to detect the expression of CD68 and c-Jun proteins in 67 cases of NSCLC samples including cancer tissues，adjacent tissues and normal tissues，and Spearman rank correlation analysis was used to investigate the correlation of CD68+cell number with the expression of c-Jun protein.Results:CD68+cell number in cancer tissues，adjacent tissues and normal tissues was 11.8±1.4，97.5±2.5，52.1±1.9，respectively，and there was statistical significance(F=52 334.934，P＜0.001).The mean optical density of c-Jun protein in cancer tissues，adjacent tissues and normal tissues was 0.25±0.03，0.23± 0.02，0.20±0.01，and there was statistical significance(F=91.280，P＜0.001).The CD68+cell number in adjacent tissues was correlated with the TNM stage(F=158.273，P＜0.001)，lymph node metastasis(F=84.985，P＜0.001)and involvement of pleura(F=16.422，P＜0.001).The expression of c-Jun in adjacent tissues was correlated with TNM stage(F=19.319，P＜0.001)，the differentiation of lung cancer(F=33.918，P＜0.001)，lymph node metastasis(F=12.155，P＜0.001)and involvement of pleura(F=8.318，P=0.005).In adjacent tissues CD68+cell number was positiuely correlated with the expression of c-Jun protein(rs=0.519，P＜0.001).Conclusion:Macrophages mainly infiltrated in tumor-adjacent tissues，and they may promote the development and metastasis of NSCLC by activating AP-1.

R734.2

*国家自然科学基金资助项目 30872095，81001239，81001240

(2011-03-21收稿 责任编辑赵秋民)