重组人IL-10在毕赤酵母X-33及SMD1168中表达效率的比较

陈富超，曹明燕，罗军敏，封建凯，孙万邦

（遵义医学院免疫学教研室暨贵州省免疫学研究生教育创新基地，贵州 遵义563000）

人IL-10（Human interleukin-10，hIL-10）是由多种细胞产生的细胞因子,活性形式通常是由非共价键连接两个单体而形成的同源寡二聚体，分子量为39kD，酸性条件下不稳定。不同宿主表达的重组hIL-10（rhIL-10）由于糖基化程度不同，分子量在35~40kD之间，说明不同宿主表达的IL-10在结构和功能上会有差异。毕赤酵母为真核生物，用于表达外源蛋白有诸多优点[1]，但不同酵母的微生物学特性各异，也决定了外源蛋白在其中的表达水平参差不齐。目前，国内外为临床试验和基础研究提供的IL-10产品大多数为大肠杆菌表达的rIL-10，其活性不稳定和副作用较明显，价格也较贵，限制了rhIL-10的应用。多数酵母表达外源蛋白的产量较低[2]，为了进一步开发产量高、具有广泛用途的hIL-10生物制品，我们选择菌株X-33和SMD1168表达rhIL-10,以期找到合适hIL-10的表达菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 rhIL-10的诱导表达及分析鉴定分别挑取重组酵母pPICZA-hIL-10/X-33、pPICZA-hIL-10/SMD1168形成的单个菌落接种到BMGY培养液中，30℃，300r/min振荡培养至OD600达到5.0，离心沉淀酵母细胞，在28℃，BMMY培养液中以终浓度为0.5%甲醇诱导培养48h后取培养液作SDS-PAGE。SDS-PAGE染色以外的凝胶以恒压100V电泳1h直接转移至PVDF膜。以5%脱脂奶粉封闭、TBST和TBS缓冲液漂洗后，加入Mouse Anti-Human IL-10作用1h，再加入羊抗鼠IgG-HRP作用1h，漂洗后进行发光反应和显影、定影及拍照。

1.2.2 rhIL-10在不同宿主菌的表达效率比较 以ELISA法分别测定48h时段30瓶pPICZA-hIL-10/X-33和pPICZA-hIL-10/SMD1168培养液的OD450，并进而换算为rhIL-10浓度，并以Bradford法检测同时段培养液总蛋白浓度，计算出rh IL-10占总蛋白的比例。

2 结果

2.1 rhIL-10的分析和鉴定 重 组酵母 p PICZA-hIL-10/X-33和pPICZA-hIL-10/SMD1168培养液经SDS-PAGE考马斯亮蓝R250染色后可见42kD左右的目的蛋白条带，还有少许杂蛋白条带。用Western blot鉴定时，则只可见42kD左右的特异蛋白条带，无杂带（见图1、图-2）。

图1 rh IL-10的SDS-PAGE分析

图2 rh IL-10蛋白印迹分析

2.2 rhIL-10的表达效率比较 用 hIL-10试剂盒经ELISA法测，pPICZA-hIL-10/X-33培养上清作5×105稀释时，OD450为 0 .821±0.085，而 p PICZA-hIL-10/SMD1168培养上清 O D450为0.136±0.091，根据标准曲线计算 p PICZA-hIL-10/X-33培养上清中 rh IL-10平均浓度为20.00mg/L，pPICZA-hIL-10/SMD1168培养上清 rhIL-10平均浓度为1.90mg/L（见表1）。Bradford法测算得两种上清总蛋白平均浓度分别为50.00 mg/L、52.12 mg/L，两种上清中rhIL-10所占比例的差异具有显著性（<0.05）（见表2）。

表1 各组rhIL-10ELISA检测结果

表2 各组rhIL-10占上清总蛋比例比较

3 讨论

临床实验研究表明，rhIL-10在感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤和器官移植[4]等方面都具有潜在的临床应用价值。表达用的宿主菌株应具备菌体生长力强、菌体内源蛋白酶较弱、性能稳定和分泌能力强的要求。Pichia.pastoris表达试剂盒中所带的X-33菌株是野生型的酵母菌株，生命力强，适用于大规模培养；无回复突变；具有较强的分泌能力，能在YPD和最小培养基中生长。虽然在X-33的菌体中存在蛋白酶，但酵母表达的蛋白在菌体内是存在于过氧化物酶体中[5]，因此在菌体内不受蛋白酶降解。SMD1168为蛋白酶A缺陷型毕赤酵母，可减少目的蛋白的降解而提高表达量[6]。本研究发现，rhIL-10在两株毕赤酵母均可以稳定表达，但以同样的条件表达rhIL-10，X-33菌株表达的产量上远高于SMD1168的表达量，而两个表达菌株表达的总蛋白没有明显差别，因此X-33菌株作为表达宿主的表达效率更高。就目前来看，以X-33菌株为宿主细胞表达IL-10的表达量在国内外也是所有真核表达中最高的。rhIL-10在毕赤酵母X-33获得了较高水平的表达，提示以生物量的积累为基础的目的蛋白的表达，以X-33菌株为表达宿主菌是个不错的选择。但表达出的rhIL-10要能得到广泛的应用，还需要进行更多有关生物学功能、副作用以及大规模发酵等方面的研究。

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[3] 陈富超,孙万邦,封建凯，等.重组h Il-10在毕赤酵母X-33的表达及其生物学活性鉴定[J].中国免疫学杂志,2011,27(8):691-694.

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[5] 李浩,李沐纯,黄秋林.IL-10和HGF对大鼠活体肝移植术后急性排斥反应的抑制作用[J].中国医学工程,2008,16(4):245-248.

[6] 封建凯,孙万邦,陈富超,等.重组h IL-10质粒构建及其在毕赤酵母SMD1168中的表达和纯化[J].生物技术通报,2010,(3):168-172.