白灵菇菌丝体多糖两种测定方法的比较

王守现，刘宇，赵爽，许峰，耿小丽，王兰青，孟莉莉

（北京市农林科学院 植保环保研究所，北京 100097）

白灵菇（Pleurotus eryngii var.nebrodensis）又名阿魏蘑、阿魏菇、阿魏侧耳，隶属于真菌门、担子菌纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属[1]。白灵菇子实体洁白，风味独特，被誉为“草原上的牛肝菌”[2]。具有丰富的营养价值，具有高蛋白、低脂肪的特点[3]，此外还具有防癌抗癌等药用功效，是一种天然保健食品[4]。白灵菇多糖含量的测定，有的采用苯酚-硫酸法[5]，有的采用蒽酮-硫酸法[6]。本文对白灵菇菌丝体多糖的2种测定方法进行了比较研究，以选定一种方便快捷的适合白灵菇菌丝体多糖含量测定的方法。

1 材料和方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 试剂

葡萄糖（分析纯）：105℃恒温烘干至恒重；95%乙醇、浓硫酸（分析纯）、蒽酮（分析纯）、苯酚（重蒸馏）、丙酮（分析纯）、乙醚（分析纯）：中国国药集团化学试剂有限公司；蒽酮一硫酸：当天配制。

1.1.2 仪器

高速万能粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；GHG-9245A型电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科学有限公司；SXT-06索氏提取器：上海洪纪仪器设备有限公司；UV-2802H型紫外可见分光光度计：上海尤尼柯仪器有限公司；旋转蒸发仪：上海亚荣仪器厂；电子分析天平：瑞士梅特勒。

1.2 材料

白灵菇发酵菌丝体提取得到的多糖：取供试菌株于250 mL三角瓶液体培养基中25℃、130 r/min活化培养6 d～7 d，然后转入500 mL三角瓶中在同一培养条件下培养3d，此时菌丝生物量最大，多糖含量高。用4层纱布过滤收集菌丝体、干燥粉碎、65℃干燥5 h～6 h至质量不发生变化，即为脱脂前粉重。根据脱脂前粉重加50倍体积的80%乙醇在索氏提取器中90℃醇析脱脂4 h；将脱脂后的菌丝粉末在65℃烘干5 h～6 h，即为水提质量；根据水提质量按1/50比例加蒸馏水，水浴锅水温控制在95℃左右，水浸提2次（第1次3 h、第2次2 h），合并水提液，抽滤、55℃～60℃真空浓缩至1/4体积左右，加4倍体积的无水乙醇使乙醇浓度为80%左右。醇沉、过夜。去上清收集沉淀于50 mL离心管中离心，先后用丙酮、乙醚多次洗涤后离心，35℃干燥。将50 mL离心管中粗多糖粉末转入10 mL离心管中称重，即得粗多糖质量，作为此次研究的供试样品。

1.3 方法

1.3.1 苯酚硫酸法

1）标准曲线的制作：吸取葡萄糖标准贮备液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL定容于10 mL容量瓶中，浓度分别为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μg/mL，摇匀。分别吸取2 mL于20 mL具塞试管中，另取2 mL蒸馏水作空白对照。各加6%苯酚（重熏）溶液1.0 mL，振摇混匀，加硫酸5.0 mL，迅速振摇混匀，于室温下静置15 min，置于100℃水浴30 min，混匀，迅速冷却，再混匀。用紫外分光光度计于490 nm波长处分别测定吸收度。以葡萄糖溶液的浓度C（μg/mL）为横坐标，吸收度A为纵坐标，绘制标准曲线。

2）稳定性实验：对同一份多糖样品，分别在0、0.5、1.0、1.5、2.0 h测定其光密度值分计算其RSD值。

3）精密度实验：从一种样品中分别吸取5 mL 8份置于50 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，吸取每份溶液2 mL，同标准曲线方法操作，测定吸光度，计算RSD值。

4）回收实验：采用加样回收法，取已知菌丝体多糖含量溶液4份，分别精密加入一定量葡萄糖溶液，按标准曲线条件下测定，计算回收率。

1.3.2 蒽酮-硫酸法

1）标准曲线的制作：吸取葡萄糖标准贮备液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL定容于10 mL容量瓶中，浓度分别为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μg/mL，摇匀。分别吸取2 mL于20 mL具塞试管中，另取2 mL蒸馏水作空白对照。于冰水浴中加入0.1%蒽酮试剂5mL。摇匀，于水浴中加热50 min。冷至室温。另取2 mL水作空白，于波长625 nm处比色，作标准曲线。以葡萄糖溶液的浓度C（μg/mL）为横坐标，吸收度A为纵坐标，绘制标准曲线。

2）稳定性实验：对同一份多糖样品，分别在0、0.5、1.0、1.5、2.0 h测定其光密度值分计算其RSD值。

3）精密度实验：从一种样品中分别吸取5 mL 8份置于50 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，吸取每份溶液2 mL，同标准曲线方法操作，测定吸光度，计算RSD值。

4）回收实验：采用加样回收法，取已知菌丝体多糖含量溶液4份，分别精密加入一定量葡萄糖溶液，按标准曲线条件下测定，计算回收率。

2 结果与分析

2.1 苯酚-硫酸法标准曲线

苯酚-硫酸法葡萄糖标准曲线见图1。

图1 苯酚-硫酸法测定不同浓度葡萄糖吸光度值Fig.1 Calbration curves of different standards with phenolsulfuric acid method of glucose

从图1可以看出，其线性回归方程为y=0.0135x+0.0543；相关系数R2=0.9888，葡萄糖含量在0～60μg/mL范围内呈良好的线性关系。

2.2 蒽酮-硫酸法标准曲线

蒽酮-硫酸法葡萄糖标准曲线见图2。

图2 蒽酮-硫酸法测定不同浓度葡萄糖吸光度值Fig.2 Calbration curves of different standards with anthronesulfuric acid method of glucose

从图2可以看出，其线性回归方程为y=0.0077x+0.0208）；相关系数R2=0.9874，葡萄糖含量在0～50μg/mL范围内呈良好的线性关系。

2.3 2种方法对白灵菇的稳定性、精密度及回收实验分析

苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法测定白灵菇菌丝体多糖的稳定性、精密度及回收实验结果见表1，表2。

表1 2种方法的稳定性、精密度及回收实验试验结果Table 1 Results of stability,precision and adding standard sample experiments by two methods

从表1可以看出，稳定性和精密度实验中，苯酚-硫酸法测定白灵菇菌丝体多糖的RSD值分别为0.71%、2.10%，均小于蒽酮-硫酸法的RSD值1.40%、9.53%，说明苯酚-硫酸法较蒽酮-硫酸法实验结果精密，各重复间误差小；而在回收实验中，苯酚-硫酸法的RSD值为14.11%，大于蒽酮-硫酸法的RSD值3.51%，说明蒽酮-硫酸法测得多糖不同回收率之间数值差异小，苯酚-硫酸法测得值差异大（如表2所示）。

表2 2种方法回收率试验Table 2 Discovery of adding standard sample experiments by two methods

从表2可以看出，蒽酮-硫酸法测定多糖回收率平均值为154.88%，大于苯酚-硫酸法的回收率平均值125.41%，说明蒽酮-硫酸法测得多糖含量较实际多糖量数值偏大，误差大。因此，苯酚-硫酸法比较适合白灵菇菌丝体多糖含量测定。

3 结论与讨论

本文采用苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法对白灵菇菌丝体多糖含量进行了测定。苯酚-硫酸法测定多糖的原理是依据糖经浓硫酸处理后脱水产生糠醛或糠醛衍生物，再与苯酚缩合生成橙黄色物质于490 nm处比色，而蒽酮-硫酸法测定多糖的原理是依据多糖浓硫酸脱水生成糠醛或其衍生物，与蒽酮试剂起缩合反应，生成蓝绿色化合物，于620 nm处比色[7]。2种方法所用的显色剂有特异性，仅与样品中特定的物质反应，具有较高的灵敏度。在白灵菇菌丝多糖含量的测定中苯酚-硫酸法较蒽酮-硫酸法测定结果灵敏、误差小、操作简便，因而苯酚-硫酸法是测定白灵菇菌丝体多糖含量较为理想的方法；但因苯酚容易氧化，见光或遇氧即逐渐氧化成淡红色，因此，在测定中应该避光且操作要迅速。在测定白灵菇菌丝体多糖的试验中，与苯酚-硫酸法相比，蒽酮-硫酸法稳定性和精密度较差，回收实验测定结果偏高，可能是由于白灵菇菌丝体中蛋白质[8]对蒽酮-硫酸法的显色反应有一定干扰所致。

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