HPLC测定不同方法提取的山黧豆中β-ODAP

赵兴秀，何义国，邓静，方春玉，孟延发

（1.四川理工学院 生物工程系，四川 自贡 643000；2.四川大学 生命科学学院，四川 成都 610064）

山黧豆（Lathyrus sativus L.）属豆科蝶形花亚科山黧豆属一年生作物，在全世界有广泛的种植，是人畜都可食用的豆科植物。其对环境具有广泛的适应性：耐寒、耐旱、抗虫害，尤其在干旱年份，在其他豆类及谷物都绝收时，它仍能维持一定的产量，是适合于干旱、半干旱地区种植的作物。山黧豆营养丰富，种子中蛋白质含量高达25%～28%，近似于小麦2倍，淀粉含量为55%～61%。而且蛋白质水解产物含有哺乳动物所需的17种主要的α-氨基酸[1]，所以是比较理想的高蛋白豆科饲料作物。但山黧豆籽实内含有一种非蛋白质氨基酸β-N-草酰基-α，β－二氨基丙酸（β－N－oxalyl－α，β－diaminopropionic，简称β-ODAP），是一种主要的毒素[2-3]，长期食用可引起下肢瘫痪，称为山黧豆中毒，从而妨碍了山黧豆的推广和种植。更进一步的研究显示，山黧豆中还存在着β－ODAP的另一种异构体，α－N－草酰 基 －α，β － 二 氨 基 丙 酸 （α －N －oxalyl－α，β －diaminopropionic，简称α-ODAP），其中β-ODAP有毒性，α-ODAP无毒性或者毒性较弱，在水溶液中加热可使这两种异构体互相转化[4]。

为了充分利用这一耐旱作物的高营养,国内外学者已经在β-ODAP的分离鉴定、化学及生物合成、分析方法、毒理学及代谢机理等方面做了大量工作[5]。这些工作都涉及到大量样品中β-ODAP和无毒的α-ODAP的分析测定。因此，研究和建立快速、方便、准确的提取和分析方法非常必要。目前，对β-ODAP的测定方法已有不少报道[5]。如用6-氨基喹啉-N-羟丁二酰亚胺氨基甲酸酯（AQC）[6]、异硫氰酸苯酯（PITC）[7]、9－芴基甲基氯甲酸酯（FMOC）[8]等试剂柱前衍生液相色谱（HPLC）法。这些方法都采用梯度洗脱，或异构体夹杂在样品中其它氨基酸色谱峰之间,分析时间长，或不能区分α和β-ODAP的异构体。Wang等[9]提出2，4-二硝基氟苯（DNFB）试剂柱前衍生的HPLC法可使α，β－ODAP最先出峰。用高氯酸提取法、乙醇提取法和水提取法进行样品的预处理，采用恒组分进行洗脱,结果发现高氯酸提取法使样品的分析时间大大缩短,这将有利于大量样品的分析。同时，还研究了3种不同提取方法对ODAP含量的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

山黧豆：购自甘肃；α，β-ODAP标样：由兰州大学应用有机化学国家重点实验室提供；衍生化试剂DNFB：购自美国Sigma公司；乙腈为色谱纯。实验中其他试剂均为分析纯。实验溶液用Molli-Q水配制。高效液相色谱仪（LC-6AD）：岛津 LC-6AD泵（2台），柱温箱为CTO-10AS，检测器为SPD-M20A，系统控制器为CBM-20A。

1.2 方法

1.2.1 提取方法

采用水提取法、30%乙醇提取法和0.2 mol/L高氯酸提取法。各法均准确称量600 mg山黧豆粉，分别加入5 mL水、30%乙醇和0.2 mol/L高氯酸中，水提取法于60℃浸取24 h，30%乙醇提取法于室温浸取24 h，高氯酸提取法于0℃～4℃浸取1 h，然后离心（12000 r/min），取上清液，保存于4℃。

1.2.2 标准品衍生化和预处理

取不同质量的标准品溶解于100 μL的NaHCO3溶液（0.5 mol/L）中，配成梯度溶液，然后加入100 μL DNFB乙腈溶液（1 μL DNFB溶解于100 μL乙腈中）。在60℃水浴中避光反应30 min后，冷却至室温，然后加入800 μL KH2PO4溶液（0.01 mol/L），摇匀后用0.45 μm膜过滤，然后进样，进样量为20 μL。

1.2.3 样品衍生化和预处理

水提取液和乙醇提取液的衍生均为：分别取100μL水提取和乙醇提取的上清液加入100 μL的NaHCO3溶液（0.5 mol/L），再加入50 μL蒸馏水，然后加入100 μL DNFB乙腈溶液（1 μL DNFB溶解于100 μL乙腈中）。在60℃水浴中避光反应30 min后，冷却至室温，然后加入650 μL KH2PO4溶液（0.01 mol/L），摇匀并用0.45 μm膜过滤，进样量为20 μL。

高氯酸提取液的衍生为：100 μL上清液加入150 μL的NaHCO3溶液,然后加入100 μL DNFB乙腈溶液。在60℃水浴中避光反应30 min后，冷却至室温，然后加入650 μL KH2PO4溶液，摇匀并用0.45 μm膜过滤，进样量为20 μL。

1.2.4 色谱条件

色谱柱：C18，250 mm×46 mm，5 μm；流动相：乙腈/溶液A（17∶83，体积比，溶液A是 K2HPO4∶二甲基甲酰胺∶水为0.03 mol∶10 mL∶990 mL的溶液，并用冰醋酸调pH为5.5）；流速：1.0 mL/min；检测波长360 nm；温度：28℃。

2 结果与分析

2.1 衍生条件的优化

根据文献[9-10]，选择DNFB的量是ODAP的3倍以及60℃水浴中避光反应30 min为最佳衍生条件。衍生后的产物比较稳定，可在室温放置一周或者4℃放置3个月，α-ODAP-DNB和β-ODAP-DNB的峰面积都不会发生改变，但是DNB-OH的面积会增加，分析认为这是由于DNFB水解引起的。

2.2 色谱条件的优化

2.2.1 流动相pH对分离效果的影响

流动相pH对分离效果的影响见图1。

图1 pH对β-ODAP-DNB和α-ODAP-DNB保留时间的影响Fig.1 Effect of pH on retention time of β-ODAP-DNB and α-ODAP-DNB

如图1所示，pH对α-ODAP-DNB和β-ODAP-DNB分离影响不大，但是当pH低于4时，发现α-ODAP-DNB和β-ODAP-DNB的峰变得很宽而且拖尾现象很严重，当pH在4～5.5范围内，α-ODAP-DNB和β-ODAP-DNB分离效果较好，而且峰形很好，无拖尾现象。

2.2.2 乙腈含量对分离效果的影响

在实验中发现：如果乙腈含量太高，α-ODAPDNB和β-ODAP-DNB分不开；乙腈含量太低，出峰较晚。经反复实验，乙腈含量为17%分离效果最好。

2.2.3 柱温对分离效果的影响

柱温对色谱峰的分离和拖尾均有一定的影响。实验得：柱温太高，α-ODAP-DNB和β-ODAP-DNB分不开，柱温太低，峰出现拖尾现象；当柱温为28℃时，既无拖尾，又能将两者分开。

所以，在标准品和样品的HPLC检测中，均将最佳色谱条件确定为：pH为5.5，柱温为28℃，流动相为乙腈/溶液A（17∶83，体积比）。

2.3 样品检测

在最佳色谱条件下，经过上样检测，得到ODAP标准品、高氯酸提取液、乙醇提取液和水提取液的色谱图（图2～图5），再用ODAP两个异构体的浓度与色谱面积（×107）回归得到工作曲线方程（表1）。

图2 ODAP标准品色谱图Fig.2 Chromatogram of ODAP standard derivatized with FDNB

图3 高氯酸提取山黧豆样品色谱图Fig.3 Typical chromatogram of the sample from Lathyrus sativus by the method of perchloric acid extraction

图4 乙醇提取山黧豆样品色谱图Fig.4 Typical chromatogram of the sample from Lathyrus sativus by the method of aqueous ethanol extraction

图5 水提取山黧豆样品色谱图Fig.5 Typical chromatogram of the sample from Lathyrus sativus by the method of water extraction

表1 α，β－ODAP的工作曲线Table 1 Calibration curve date of α，β－ODAP

从表1可以看出，两个回归方程的相关系数分别为以0.9784和0.9818，说明β-ODAP和α-ODAP浓度都与其峰面积具有非常好的线性关系，从而可以根据峰面积直接得出两种化合物的浓度和含量。

根据曲线方程得到3种不同方法提取的萃取液中的β-ODAP和α-ODAP的含量，结果见表2。

表2 不同方法得到的样品提取液的分析结果Table 2 Contents of α，β－ODAP in Lathyrus sativus via three extraction methods

从表2可以看出，30%乙醇提取的β-ODAP和α-ODAP的最大量分别为0.497%和0.229%，而采用水和高氯酸提取法β-ODAP的最大量可以达到为0.528%和0.529%，α-ODAP的最大量为0.258%和0.256%。其提取效果均高于30%乙醇提法。

3 结论

水提取法和0.2 mol/L高氯酸提取法效果相当。其中水提法得到的上清液中β-ODAP的含量为0.522%，α-ODAP的含量为0.252%；高氯酸提取法得到的上清液中β-ODAP的含量为0.523%，α-ODAP的含量为0.251%；而30%乙醇提取法不如水提法和高氯酸提取效果好，其上清液中β-ODAP的含量为0.492%，α-ODAP的含量为0.225%。但是水和乙醇提取法耗时长，均需24 h。而0.2 mol/L高氯酸提取法耗时短，只需要在0℃～4℃提取1 h，这就有利于大量样品的分析，为进一步制备纯化等研究奠定了基础。

[1]HANBURYCD,WHITECL,MULLANBP,et al.A review of the potential of Lathyrus sativus L.and L.cicera L.grain for use as animal feed[J].Anim Feed Science and Technology,2000,87(2):1-27

[2]MURTIVVS,SESHADRITR,VENKITASUBRAMANIANTA.Neurotoxic compound of the seeds of Lathyrus sativus[J].Phytochemistry,1964,3(6):73-78

[3]RAOSLN,ADIGA P R,SARMA P S.The isolation and chraracterization of β -N-oxalyl-α，β -diaminopropionic acid:a neurotoin from the seeds of Lathyrus sativus[J].Biochemistry,1964,3(3):432-436

[4]李志孝,孟延发,张立,等.山黧豆中α-及β-草酰二氨基丙酸相对含量的电泳测定[J].兰州大学学报:自然科学版,1992,28:89-92

[5]严则义,邢更妹,王崇英，等.家山黧豆及其毒素ODAP的研究[J].西北植物学报,2004,24(5):911-920

[6]CHEN X,WANG F,CHEN Q,et al.Analysis of neurotoxin 3-N-oxaly-L-2,3-diamino propionic acid and its α-isomer in Lathyrus sativus by high performance liquid chromatography with 6-anino-quinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate（AQC）derivatization[J].J Agric Food Chem,2000,48(5):3383-3386

[7]KHANJK,KUOYH,KEBEDEN,et al.Determination of non-protein amino acids and toxins in Lathyrus by high performance liquid chromatography with 6 -anino －quinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate（AQC）derivatization[J].Chromatogr,1994,687(4):113-119

[8]GEDA A,BRIGGS C J,VENKATARAN S J.Determination of the neurolathyrogen β -N-oxalyl-α, β -diaminopropionic acid using high performance liquid chromatography with fluorometric detection[J].Chromatogr.,1993,635(3):338-341

[9]WANG F,CHEN Q,QIN X C,et al.Determination of neurotoxin 3-N-oxaly-L-2,3-diamino propionic acid and non-protein amino acids in Lathyrus sativus by precolumn derivatization with 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene[J].Journal of Chromatography,2000,883(2):113-118

[10]张海霞,刘满仓,靳小舜,等.2,4-二硝其氟苯柱前衍生测定山黧豆毒素ODAP[J].分析化学,2006,34(1):100-102