菌种选育技术在葡萄酒酿造中的应用与发展

崔艳，吕文，庞红勋，刘金福

（1.天津农学院 食品科学系，天津 300384；2.中法合营王朝葡萄酿酒有限公司，天津 300402）

葡萄酒是采用新鲜葡萄或葡萄汁经完全或部分酒精发酵而得到的饮料。通过酿酒酵母（Saccharomsyces cerevisiae）的酒精发酵和自溶，产生了如甘油、醋酸、琥珀酸、丙酮酸、酯类物质、蛋白质和多糖类物质，这些物质的产生对葡萄酒的酒体、颜色、香气和风味，乃至葡萄酒整体质量都具有重要的影响，因此具有优良性状酵母的选育非常重要。

随着科技手段的提高和分子生物学研究的深入发展，葡萄酒酿酒酵母的选育已经不再局限于只考虑酿酒酵母菌自身特点，人们的适饮性需求、酿造工艺、地域特点,风土环境对菌种的影响及其协同作用、以及基因工程菌的构建也越来越多地成为近年来的研究热点。另外本土化特色酵母菌的选育也越来越成为酿造风格独特的葡萄酒的热点。本文就近年来国内外葡萄酿酒酵母选育技术的进展进行综述,为我国本土化酵母菌的实际应用提供参考。

1 酿酒酵母菌研究的基础和主要考虑因素

自1997年完成了酿酒酵母菌全基因组的序列测定后，科学家们相继建立了酿酒酵母基因组数据库和酵母蛋白质组数据库，其中容纳了有关酵母菌的基因和其蛋白质功能、结构和相互间关系等大量信息，再加上近年来DNA微矩阵分析的发展，为原子和分子水平的酵母特性研究、优良表型特征基因的鉴定和酵母菌的基因工程构建打下了坚实的基础。

在葡萄酒用酵母菌的选育中，有两类因素影响着研究的方向和出发点。一类是较复杂的影响葡萄酒质量的因素，包括一类，二类香气物质和其他感官特性的因素，另一类是出于工艺考虑：如耐受性（例如糖，SO2，酒精含量、抗真菌素，低温和高温等）、嗜杀型、化学稳定性、生长模式等工艺因素。表1和表2列出了当前选育酿酒酵母的主要参考因素。

2 国内外葡萄酒酵母选育和改良方法的进展和利弊

从1960年开始，一些微生物育种方法产生并得到了发展和应用，自然选育，诱变、杂交育种，原生质体融合,基因工程育种都是当前最普遍的育种手段，而且各有利弊，在菌种的选育时，一定要立足出发点，将不同的育种方法配合使用，才能够真正筛选出优良的酵母菌。

表1 酵母菌选育的主要参考工艺因素Table 1 The main technique factors in wine selection

表2 酵母菌选育的主要参考质量因素Table 2 The main quality factors in wine yeast selection

2.1 自然选育

自然选育即不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程。自然突变被认为是由多因素低剂量的诱变效应引起的，这样的突变可使野生的酵母菌天然具有某种较突出的特性。众所周知，老世界葡萄酒产国通过野生酵母自然发酵的葡萄酒无论在复杂感、结构、香气、地域特色方面都是其他地区无法比拟的。经研究发现在它们的葡萄园中筛出的假丝酵母（Candida）、克勒克酵母（Kloeckera）、有孢汉逊酵母（Hanseniasporacan）可通过代谢和自溶提高葡萄酒的香气，参与复杂新鲜的风味物质的形成[1]。现在，许多国外的酵母生产厂家利用自然选育的方法生产纯种的酿酒酵母产品，这类商用葡萄酒酵母已在许多新世界葡萄酒生产国（澳大利亚，美国，南非，智利、中国等）的大规模工业化生产中被广泛应用。使用这类商用酵母优点是易于管理，保障了发酵的顺利进行；缺点是使新世界的葡萄酒酒体较单调、缺乏个性和特点，相同或相近产区的葡萄酒风味趋于同质化。因此国外的科研人员近年来逐步开展了自然选育具有特殊功能酵母菌的研究，希望通过这类酵母菌的使用，弥补葡萄原料品质的不足，或满足特殊生产工艺的要求。例如有人从Parmesan干酪乳清中筛出的酿酒酵母具有降低葡萄酒中苹果酸的作用，最高降幅可达50%[2]，这类酵母适用于冷凉产区酸度较高的葡萄原料的发酵，有利于降低葡萄酒过强的酸感。还有人从葡萄酒生产中筛出的酵母菌（Saccharomyces uvarum）在低温下（6℃～10℃）具有较强的发酵力，可用来发酵冷藏的葡萄汁，其最主要的特点是能够合成苹果酸，可以改善炎热产区葡萄原料酸度不够的问题；同时它能产少量的醋酸和大量的甘油和琥珀酸,对于改善葡萄酒的香气也有重要的影响[3]。有科学家已筛选出在发酵过程中不积累尿素的酵母，对降低葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量具有积极的意义[4]。2009年在新西兰Kumeu River葡萄酒厂发现了近100种独特的酵母菌株，包含6种不同形态，之间并未杂交繁殖，且与商用菌株毫无关联，这些酵母或许会成为揭示新西兰葡萄酒风味特性的有效工具[5]。

由于酵母菌株自发突变几率很低，只靠从群体中筛选出个别有价值的优良突变体的机会相对较少，因此从自然界直接筛选的野生酵母，较难具有葡萄酒所要求的复杂的理想特性，有时需进一步的人工干预，才能达到目的。然而，近年来为了获得安全的、具有地域风格的菌株，很多的葡萄酒国家重新开始重视自然选育。

2.2 诱变育种

诱变育种即利用物理或化学的方法处理均匀分散的微生物群体，使其基因突变频率大幅度提高，从中挑选少数符合目的的突变菌株以供使用的育种方法。国外科研人员对二次发酵香槟酒的酿酒酵母进行诱变，通过改善其自溶特性缩短酵母多糖和甘露糖蛋白等物质的溶出时间，可使瓶内二次发酵香槟酒的瓶储期缩短3～6个月，达到缩短陈酿期的目的[6]。还有人通过该法改善了酿酒酵母对氮源的利用方式，解除了氨基酸利用途径的阻遏作用，同时提高了发酵速率，缩短了发酵时间[7]。我国的科研人员发现红外CO2激光辐照诱变可使菌株产乙醇能力有较大的变化[8]，甲磺酸乙酯（EMS）诱变可筛出低产H2S和高产谷胱甘肽（GSH）的突变株[9]。

尽管诱变育种简单易行，但研究发现酵母菌的基因结构使得这种育种方法应用起来有局限性，因为大部分的酵母基因都有2个以上的拷贝，因此选择隐性突变是很困难的，而且长期使用诱变剂会导致菌种疲劳，遗传很不稳定。

2.3 杂交育种

杂交育种是利用酵母在营养缺乏时的有性繁殖、不同遗传特性和相反交配型的细胞产生双倍体等特点进行育种的方法。杂交育种的目的一般是为了使菌种性状满足酿造工艺的特殊要求。比较典型的例子是国外运用这种技术成功地将一个嗜杀酵母的单倍体和一个耐SO2的单倍体进行杂交，所获得的新酵母菌增强了耐SO2能力，提高了抵御杂菌污染的能力和发酵效率[10]。由于我国葡萄产区大多在采收季节前后降雨量较多，较高的环境湿度使葡萄易被有害微生物侵染，具有嗜杀特性和耐SO2能力的酵母对于葡萄质量不佳的产区具有较好的发酵效果。国外在葡萄酒酵母杂交育种方面已做了许多科学研究，有人将筛自乳清的酿酒酵母与葡萄汁酵母杂交，其杂合子具有更强的降解苹果酸能力和较低的产乙酸能力[11]，这项研究对选育红葡萄酒酵母具有指导作用。有人将一种絮凝的酵母菌和一种不产H2S的酵母菌进行了杂交用于起泡葡萄酒的发酵[12]，新菌种有利于发酵后排除酒泥、提高酒体澄清度，并能改善酒体香气和口感。还有人成功地将耐寒的葡萄汁酵母菌和不耐寒的酿酒酵母进行了杂交[13]，选育出的酵母菌可在5℃～10℃条件下具有较好的发酵能力，有利于果香型葡萄酒的酿造。我国在葡萄酒酵母杂交育种方面的研究还较少。

酵母菌杂交育种也存在一定局限性，主要是由于酵母菌的多倍体基因排列，使得自然界中能形成孢子的菌株出现几率很小，还有一些特殊的酵母菌属间杂交不会将结合子的理想特性传递给子代，另外，能够被交换或传递到子代、结合子上的理想性状特点也是有限的。

2.4 原生质体融合

原和质体融合是将2种不同菌株的原生质体（球）置于高渗溶液中，在一定融合剂的促融作用下相互凝集并发生细胞之间的融合，进而导致基因重组，获得融合了亲本优良性能新菌株的育种方法，这种技术可以在属内和属间进行。国外曾报道过一些重要的工业用酿酒酵母菌就是自然界中属间杂交的结果[14]。有人通过跨界融合酿酒酵母和葡萄汁酵母发现，融合子所产的葡萄酒中的副产物的含量大约是亲本的一半，因为该亲本具有过高的产酸、产甘油以及产苯乙醇的能力[13]。国内有人对酿酒酵母与酒类酒球菌（Oenos.oeni）进行了跨界融合，发现融合子质粒DNA中存在苹果酸-乳酸酶基因MleP和苹果酸-乳酸透性酶基因MleP，从而实现了葡萄酒降酸[15]。国内还有研究将葡萄酒酵母与裂殖酵母进行融合，选育出能够一步降解苹果酸的酵母[16]；以及利用单灭活原生质体融合技术选育出降酸能力强的酵母菌株[17]。

此技术具有杂交频率较高、受接合型限制较小、遗传物质完整等优点，但是，由于所获得的融合子其遗传稳定性较差，通常理想特点的表达是偶然的。再加上缺乏遗传标记，用做工业菌种还是有一定的障碍。

2.5 基因工程育种

上述的酵母改良技术都是随机地改变菌种特性，缺乏特异性和准确性。基因工程育种克服了这一缺点，把理想的外源DNA片段克隆或插入到葡萄酒酿酒酵母菌基因的特定位置中，实现DNA重组，使其得到表达，并稳定遗传而不改变受体原有特性。

在研究中发现，当一个或者几个已知基因编码优良特征时，基因工程菌的构建是容易且可行的。有人构建了具有果胶降解、葡聚糖降解和木聚糖降解能力的酿酒酵母，使葡萄酒澄清变得容易[18]。有人通过构建能充分表达甘油磷酸脱氢酶基因的高产甘油酵母菌，酿造出了低醇兼有圆润酒体香的葡萄酒[19]。由于酿酒酵母中没有苹果酸乳酸途径，又缺乏苹果酸运输系统，因此有人将乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）中的苹乳酶基因和粟酒裂殖酵母 （Schizosaccharomyces pombe）中的苹果酸透性酶基因转入酿酒酵母而成功降酸，解决了冷凉产区葡萄酒生物降酸的难题[20-21]。有人发现在单倍体和二倍体阶段进行基因处理，可在自溶程度、酒精耐受性和工艺可行性方面明显提高起泡葡萄酒的质量[22]。有人利用氮代谢的调节机制，构建了促进尿素酰氨分解酶表达的基因工程菌，有效降低了酒中尿素的含量，从而大幅降低了葡萄酒中氨基甲酸乙酯的浓度[23]。还有人描述了通过构建KNR4基因敲除酵母菌，细胞壁的结构和成分得以改变，增加了葡萄酒中甘露糖蛋白的表达，还有效防止了葡萄酒蛋白质浑浊[24]。

然而例如发酵力，产酒精能力，耐受性和培养温度等工艺特征因素并不是由单一的或少数几个基因控制的，决定这些特性的基因往往广泛分布于整个酵母菌基因组中，有科学家已推测出决定酒精耐受性的基因多于250个，而这些位点通常是我们了解很少又分布很广的。尽管近几年微卫星和单核苷酸多态性方法成功地用于绘制基因谱图,但是像这样特征复杂的基因识别仍然是当前遗传学的一个挑战。因此仅利用基因工程菌的构建仍然不能解决这些因素带来的问题。

近年来一项不改变单个基因，而是随机地改变整个基因组的基因组改组（Genome shuffling）技术引起了研究人员极大的兴趣，它在诱变基础上通过细胞融合技术，对诱变后的细胞进行重组，从而使正向突变菌株的优点结合在一起。它能将多重亲本的优良性状在体外整合到一个子代身上，快速地完成优良性状的重组和选育，被称为递推式多次融合。但是由于缺乏有效的识别复杂表型的方法，和将具有理想特征的子代从庞大的重组菌种库中有效分离出来的方法，这一技术还没有在葡萄酒酵母中获得应用，如果这一瓶颈得以攻克，该技术将成为酵母选育的一个重要的里程碑，且基于其自然选育的原则，产生的后代将不会冠以“转基因菌”的头衔，因此将有很大的发展前景。

3 对我国葡萄酒酵母发展的展望

我国葡萄酒年产量在2009年已经达到93万t，跻身世界葡萄酒生产国十强，但我国在葡萄酒酿酒酵母研究方面与国外相比还处于起步阶段，葡萄酒行业的生产还以购买使用国外商用酵母为主。由于我国酿酒葡萄产区分布广泛，土壤气候条件存在具有较大差异，因此不同产区的葡萄原料在品种、品质、特征等方面存在较大的差异。如何根据不同产区葡萄品种的特点，选育适合发挥我国本土原料优势特性的酿酒酵母，是从事葡萄酒科研工作者需要面对的问题。例如通过适宜的菌种选育，在我国东部产区推广酿造口感柔和细腻的新鲜果香型葡萄酒、在我国中西部产区推广酿造口感浓郁醇厚的陈酿型葡萄酒是我国葡萄酒行业未来发展的一个基本方向。

从技术角度来讲，酿酒酵母作为一个实验室真菌模型，其生理生化、基因和分子生物学特性已经为大家所熟知，但实验室菌种和工业菌种在遗传和生理方面仍然有很大不同，还需进一步研究。无论是理性的DNA重组技术还是随机的诱变或者杂交融合等技术，都有优缺点，都会遇到困难，我们应该按照选育出发点的不同，扬长避短，各种技术互为补充、配合使用，努力培育出具有我国产区特色的本土葡萄酒酵母，为提高我国葡萄酒的整体质量，推动我国的葡萄酒产业的稳步健康发展提供可靠的技术支持。

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