HPLC-ICP-MS联用技术在有机砷形态分析中的应用

肖亚兵，阎华，陈其勇

（1.天津出入境检验检疫局，天津 300461；2.湖北省武汉市青山区环保局，湖北 武汉 430080）

砷是一种毒性很强的元素，砷的毒性主要取决于其化学形态，因此现在对砷的形态分析研究越来越多，其中有机砷的形态分析倍受重视。有机砷的形态包括很多种，见表1，有机砷的形态不同，其毒性差异也很大。一甲基砷酸（MMA）和二甲基砷酸（DMA）已被证明是潜在的致癌物质[1]，而砷甜菜碱（AsB）和砷胆碱（AsC）则被认为是无毒的[2]。近几年来，有机砷制剂作为一种饲料添加剂广泛应用于家禽养殖业[3]。有机砷类制剂具有刺激动物生长的作用，而且具有较广的抗菌谱，可以改善禽肉的肉质。有机砷类制剂主要包括阿散酸（p-ASA）、洛克沙砷（3-ROX）、硝基苯砷酸（4-NPAA）和脲基苯砷酸（p-UPAA）。虽然有机砷的毒性很低，但大剂量作用时，也会导致中毒，如洛克沙砷可使动物中枢神经系统失调，使脑病和视神经萎缩的发病率提高。另外还能够对环境造成很大的污染，畜禽日粮中如果大量使用有机砷制剂，其含砷的畜禽排泄物进入环境，使土壤、空气、水遭受严重污染。因此在食品和环境样品中进行有机砷的形态分析是有必要的。

表1 几种常见的有机砷形态化合物Table 1 List of organicarsenic species compounds

有机砷的形态分析通常包括两步：一是各种有机砷形态的分离，二是对各种有机砷形态的检测。虽然有机砷的形态分析方法包括很多，如分光光度法[4-5]、电化学法[6]、气相色谱-质谱法（GC-MS）[7-9]、液相色谱法[10]、液相色谱-质谱-质谱法（LC-MS-MS）[11-12]、原子吸收法（AAS）[13-14]、电感耦合等离子体-原子发射光谱法（ICPAES）[15]、原子荧光法（AFS）[16]，但高效液相色谱-电感耦合等离子体-质谱（HPLC-ICP-MS）联用技术应用最为广泛。HPLC是一种具有高效、高灵敏度的分离手段，尤其适用于热稳定性差、分子量大、极性强的物质的分离，根据分离机制的不同，液相色谱有多种分离方式。ICP-MS分析技术具有极低的检测限、宽的线性范围、干扰少、分析精密度高、速度快和可同时测定多元素等优点，能在复杂基体中准确的分析痕量元素。特别是ICP-MS作为HPLC的检测器，跟踪被测元素在各形态中的信号变化，使得色谱图变得简单，消除了基体干扰，有助于元素形态确认和进行定量分析。因此HPLCICP-MS联用技术已成为有机砷形态分析的强有力的手段。本文将就HPLC-ICP-MS联用技术在有机砷形态分析中的应用作一综述。

1 HPLC与ICP-MS联用接口技术

ICP-MS在元素形态分析中的应用已有了大量的介绍[17]。在ICP-MS分析中，ICP的原子化和离子化结合了质谱（MS）的特异性和检测的灵敏性。ICP具有高效及强大的电离源，等离子体能在5000K-10000 K的温度和常压下工作，当样品雾化进入等离子源后，被分析物气化、原子化和离子化几乎同时进行，最后被测元素进入质谱来检测。

HPLC与ICP-MS联用的关键是接口技术，即样品溶液经HPLC分离后在线的引入ICP的雾化系统。ICPMS是为液体样品基质而设计的，HPLC柱与雾化器连接也没什么问题，而且HPLC的柱后流出液的压力与ICP样品导入系统都是在常压下进行的，因此将HPLC与ICP联机就变得十分简单。HPLC与ICP接口技术与检测器的类型有很大关系，HPLC应用的主要原则之一就是流动相要与检测系统相匹配。HPLC流动相的流速通常为0.1 mL/min～1 mL/min，这与ICP常用的气动式雾化器：交叉流（cross flow）雾化器、Babington雾化器和同心（concentric）雾化器的样品导入流速是相匹配的。而当使用UV检测器时，通常在反相HPLC中用钠或钾的磷酸盐缓冲溶液做流动相，因为磷酸盐缓冲溶液在紫外区没有吸收，但这种缓冲溶液做流动相却不适合于质谱检测器。非挥发性缓冲盐溶液聚集在lenses和skimmer cones上，从而导致信号不稳定和“记忆”效应。因此对ICP-MS来说，要使用挥发性缓冲盐溶液或是在ICP-MS系统中残留低的溶剂[18]，有机酸的铵盐和碳酸铵由于其低残留就很适合于ICP-MS。也有将硝酸作为砷形态分析的流动相，但是在砷形态峰中有As5+的峰，所以具有氧化性的硝酸做流动相不适用于砷的形态分析。另外，HPLC的流动相中通常含有一定比例的有机溶剂，如甲醇和乙睛等，有机溶剂在ICP中所产生的碳可造成ICP-MS的进样管和采样锥、截取锥两锥孔变得越来越小甚至堵塞，导致ICP-MS的信号不稳定，因此可在溶剂到达ICP前将样品溶液雾化成气溶胶，或降低喷射室温度使溶剂浓缩都能起到去溶作用，从而保持ICP的稳定。超声雾化是ICP的一种样品导入方式，超声雾化器是用超声波的振动作用将样品溶液雾化成气溶胶，能以很高的效率获得雾滴颗粒小、分布均匀的高质量的气溶胶，大大提高了雾化效率而改善ICP-MS的检测限。但超声雾化器易受溶液性质（如黏性、颗粒等）的影响，具有一定的“记忆”效应。在HPLC柱后采取低流速或者使用小孔或微孔柱也可以减少有机溶剂进入检测器的量，小孔和微孔柱是HPLC色谱柱技术的发展方向，它可以降低流动相的消耗量并且降低组分在色谱柱分散变宽，提高柱效。与传统柱径如4.6 mm相比，小柱径的种类很多，如2.0 mm、1.0 mm的微柱及300 μm的毛细柱，相应的其流动相的流速在0.01mL/min～0.1mL/min之间。如Pergantis[19]等使用1mm的微柱,以流速0.04mL/min分离了洛克沙砷等有机砷饲料添加剂。

2 有机砷形态的HPLC分离

HPLC具有高度样品预处理能力，不需复杂的萃取和衍生步骤，比较适合于非挥发性物质的分离，因此在有机砷的分离中普遍采用HPLC法，有机砷化合物的物理、化学性质（如pKa值、极性、可溶性等）影响着HPLC系统的选择。如一甲砷酸（MMA）的pKa值有两个：2.6，8.2；二甲砷酸（DMA）的pKa值是6.2；砷甜菜碱的pKa值是2.2；而其它有As=O键的有机砷在低pH条件下易质子化而显阳离子。对有机砷制剂（如阿散酸、洛克沙砷）来说，由于其弱酸性，因而降低流动相的pH（如添加少量三氟乙酸或甲酸）可以改善其峰形。如肖亚兵[20]等以甲醇-0.1%三氟乙酸水溶液（1∶9）为流动相，HPLC-ICP-MS法同时测定了动物源性食品中阿散酸、洛克沙砷和硝苯砷酸的残留量。Thompson[21]是最先提出HPLC和ICP-MS联用的，在他们的研究中，HPLCICP-MS检测砷的绝对检测限为0.1 ng～0.2 ng。在有机砷形态分析中，使用比较广泛的是离子交换色谱（ionexchange chromatography）和离子对色谱（ion-pair chromatography）。如前所述，ICP-MS对砷的低检测限以及与HPLC联结的容易性使得ICP-MS成为有机砷形态分析最佳的方法。另外胶束色谱也应用于一些有机砷的形态分离。本文主要从离子交换色谱和离子对色谱两个部分来描述不同的色谱分离模式。

2.1 离子交换HPLC

离子交换色谱主要是用于离子和易离子化的物质的分离，其机理是利用固定相中的表面活性离子与流动相中相反电荷离子的交换平衡。包含两种类型：表面活性离子带负电荷的称为阳离子交换色谱，带正电荷的称为阴离子交换色谱。溶质的离子强度、缓冲溶液的浓度和离子强度、温度以及流动相的pH、流速和流动相中的有机溶剂都影响着被分析物的分离和保留时间。离子交换色谱在有机砷形态分析中应用十分广泛，阴离子交换常用于MMA和DMA的分离，而阳离子交换常用于分离AsB、AsC、TMAO和Me4As+。刘桂华[22]等采用阴离子交换柱来分离紫菜萃取物中的MMA、DMA。Suzuki[23-24]等用36 mmol/L甲酸和2 mmol/L甲酸铵（pH2.8）水溶液为流动相，以流速为0.8 mL/min在Shodex Rspak NN-614（150 mm×6.0 mm）阳离子交换柱上分离MMA、DMA和AsB。通常用于离子交换色谱分离极性砷化合物的缓冲系统包括：磷酸盐、碳酸盐、苯二甲酸、氢氧化四甲铵和甲酸盐缓冲液。如前所述，钠或钾的磷酸盐缓冲液由于在ICP-MS的进样器和skimmer cones上有残留而不被采用，而碳酸铵由于残留少，长时间使用后也无信号漂移常用于阴离子交换系统中。在B‘Hymer和Caruso[18]的报道中，即使色谱运转15 h以后，进样器和skimmer cones上也没有过多的残留，这是因为在5000 K～10000 K的等离子体中，除了氨、CO2和水外没有别的残留。所以碳酸铵是用于ICP-MS的最好缓冲液。苯二甲酸、甲酸及氢氧化四甲铵缓冲液用在ICPMS上也有同样的优点。

在传统的离子交换系统中，等度洗脱是比较常用的。这种洗脱方式可用于一些中性的砷形态化合物。不论是等度洗脱还是梯度淋洗的离子交换系统都能适合于有机砷的形态分离，在已报道的文献中，等度洗脱占主要地位，B.P.Jackson等[25]使用了3种离子色谱柱来分离ROX、p-ASA、DMA、和MMA：在As14柱中使用磷酸根洗脱剂，在As16柱中使用羟基洗脱剂，在As7柱中使用HNO3作洗脱剂都使这些化合物得到了很好的分离。3种方法对所有种类的有机砷化合物的检测限都低于0.5μg/L，而As16和As7柱中检测限都低于0.05μg/L。梯度淋洗与等度洗脱相比有较高的塔板数、较好的形态分离效果以及较少的保留时间。B‘Hymer和Caruso[18]使用阴离子交换柱Hamilton PRP-X100（150 mm×4.1 mm i.d.），流动相A（12.5 mmol/L碳酸铵）和流动相B（50 mmol/L碳酸铵），以流速0.8 mL/min，梯度洗脱程序：0 min～8 min，100%A；8 min～20 min，100%A-100%B；20 min～30 min，100%B分离了AsC、AsB、MMA和DMA。Sloth[26]等还利用梯度阳离子交换系统来分析海产品中的有机砷形态。

另外，在等度多模式离子交换系统中，硝酸铵和硝酸缓冲液被用来分离标准水溶液中的MMA、DMA和AsB，此方法[27]也用于土壤水的测定。

2.2 离子对HPLC

用于有机砷形态分离的离子对色谱类型为反相离子对色谱。简单的反相HPLC使用的流动相是含有有机溶剂的水溶液，固定相的极性小于流动相。在反相离子对色谱中，将反离子水溶性缓冲溶液加入到流动相中，利用离子对生成的化学平衡来调节各形态的选择和保留，离子对HPLC最大的优点是能分离离子形态以及不带电的分子形态。常用的离子对试剂是长链的烷基离子，如烷基磺酸盐（通常含有5个以上的碳链）和四烷基铵盐。流动相中离子对试剂的浓度较低（约0.02 M或更低），洗脱及分离时采用含有机试剂的水溶液，当用ICP-MS检测有机砷形态时用甲醇溶液。在离子对色谱中，被分析物的分离受以下几个因素的影响：反离子的疏水性、离子对试剂的浓度、缓冲液的浓度、流动相的pH和离子强度以及固定相的特性。由于反相离子对色谱操作简便、柱效高，因此广泛应用于有机砷形态的分离。Pergantis[19]等采用反相离子对微孔高效液相色谱-电感耦合等离子体-质谱法（RP-IP-HPLC-ICPMS）分别检测了4种有机砷动物饲料添加剂，羟基苯砷酸和阿散酸的检测限为0.10μg/L，洛克沙砷的检测限为0.12μg/L，硝苯砷酸的检测限为0.26μg/L，该法所需样品体积少(＜1μL，流动相流速低（15μL/min～40μL/min），产生的废弃物少，而且选择性和灵敏度高。B‘Hymer[28]等实验了不同的喷雾器，用pH2.4的含有25 mmol/L柠檬酸和10 mmol/L五烷基磺酸钠的水溶液为流动相，小孔C18柱等度离子对HPLC分离了MMA、DMA、AsB和AsC，该法对各有机砷化合物的检测限都在1μg/L以下。在HPLC-ICP-MS检测有机砷形态中，一般不采用梯度离子对HPLC，因为流动相中的有机成分改变会造成信号漂移。B‘Hymer和Caruso[18]用含有40 mmol/L柠檬酸和10 mmol/L六烷基磺酸钠的水溶液为流动相来分离MMA、DMA、AsB和AsC的标准溶液，水相-有机相（甲醇）的比例在30 min内由流动相A（98∶2或96∶4）逐渐增加有机相（甲醇）到流动相B（88∶12或86∶14）。在此研究中，无法解决MMA的峰形，而且ICP-MS系统中基线出现了漂移。使用离子对HPLC快速洗脱有机砷形态化合物是一种新趋势。Wrobel[29]等使用七烷基磺酸钠和柠檬酸缓冲系统在4 min内将MMA、DMA和AsB粗略的洗脱出来。虽然这种色谱系统能够缩短洗脱时间，但对As5+和MMA缺乏分离能力。因此快速色谱系统与传统色谱系统相比较虽然缩短了被分析物的保留时间，但对被分析物的分离效果不好，特别是当样品基质影响到色谱的分离时。

3 总结与展望

有机砷的形态分析在今后会越来越重要，HPLCICP-MS联用技术是迄今为止有机砷形态分析最有效的途径，它融合了HPLC稳定、高效分离的特点和ICPMS具有的灵敏度高、线性范围宽及能跟踪被测元素在各形态中的信号变化，使色谱图变得简单，有助于元素形态的确认等优点。虽然将HPLC与ICP-MS连接非常简单，但其带进ICP中的有机溶剂多，因而HPLC-ICPMS是该技术检测有机砷形态的发展方向。另外相应的与ICP-MS的接口装置也是该联用技术发展的重点，氢化物发生（HG）-一种柱后衍生过程是ICP-MS检测有机砷形态的较好接口装置，具有高灵敏度、低检测限及能更好的将被分析物传送到ICP-MS等优点。Nakazato[30]等使用HG接口检测了海水样品中的MMA，Yehl[31]等也使用HG测定了土壤提取液中的有机砷形态。

另外，在有机砷形态分析中，样品的前处理也是非常重要的。无论采取什么样的提取方法都必须保证将样品中的有机砷形态“原样的”分离出来，因此发展应用各种有效的前处理技术也是有机砷形态分析的关键步骤。

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