κ-卡拉胶邻苯二甲酰基化衍生物的抗氧化活性研究

孙 涛，陶慧娜，周冬香，毛 芳，谢 晶

上海海洋大学食品学院，上海201306

κ-卡拉胶邻苯二甲酰基化衍生物的抗氧化活性研究

孙 涛*，陶慧娜，周冬香，毛 芳，谢 晶

上海海洋大学食品学院，上海201306

对κ-卡拉胶进行酸降解得到三种卡拉胶低聚糖，并进一步与苯二甲酰基合成制得三种分子量分别为1450、2520和3430的κ-卡拉胶邻苯二甲酰衍生物(LA、LB和LC)。对产物进行IR表征并对其取代度(DS)进行测定，并检测了产物对羟基自由基·OH、DPPH自由基和过氧化氢的清除活性以及还原能力。结果表明，上述三种κ-卡拉胶邻苯二甲酰衍生物的抗氧化能力强弱顺序依次为:LC＞LA＞LB，这可能与衍生物的羟基含量、取代基团的性质以及取代度等因素有关。

κ-卡拉胶;酸降解;邻苯二甲酰基;抗氧化活性

作为一种天然硫酸多糖，近年来，卡拉胶及其衍生物的生物活性日益受到关注。由于卡拉胶分子量大，溶解性差，使它的应用受到了很大的限制。对其进行设计改性，采用降解和接枝修饰等手段，获得水溶性较好各类衍生物，对于开发海洋新药具有重要的价值［1］。2000年，Yamada等［2］通过引入不同长度的直链酸酐(C4、C6、C12)对降解后的κ-和λ-卡拉胶低聚糖进行酰基化，结果发现:酰基化后的κ-和λ-卡拉胶的抗HIV活性得到提高，同时抗凝血活性降低。此后相继出现了用马来酸酐［3］、琥珀酸酐［4］和醋酸酐［5］等酸酐对低分子量κ-卡拉胶进行结构改性的报道，发现酰基化后的κ-卡拉胶的生物活性得到大幅提高。郭锡坤等［6］的研究表明卡拉胶经过邻苯二甲酰化后清除超氧阴离子自由基能力明显增强，而且具有显著的血细胞凝集活性。本文通过合成得到三种不同分子量、不同取代度的κ-卡拉胶邻苯二甲酰衍生物，并比较了它们的抗氧化活性，考察了其对抗氧化活性的影响。以期为卡拉胶的进一步高值化研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

κ-卡拉胶(食品级，上海联合食品添加剂有限公司);鲁米诺、DPPH(Sigma公司);其余试剂(均为分析纯，上海化学试剂公司);抗氧化测试所需溶液，由二次蒸馏水配制。

WFZ UV2000型紫外分光光度计(上海合利仪器有限公司);Delta 320型pH计(梅特勒—托利多仪分析仪器上海有限公司);IFFM-D型流动注射化学发光分析仪(西安瑞迈科技有限公司);JB90-D型强力电动搅拌机，METTLER AE200型电子分析天平，JI80-2B型台式离心机。

1.2 拉胶低聚糖的制备

将30 g κ-卡拉胶(A)溶于1200 mL浓度为0.2 mol/L的HCl溶液中，于60℃下降解4 h。冷却，用0.2 mol/L NaOH调节溶液pH至7.0，先通过微孔过滤器过滤(0.45 μm)，然后在蒸馏水中透析(3500，7000，14000)6 d，冷冻干燥后分别得到三种卡拉胶低聚糖［4］。

1.3 邻苯二甲酰衍生物的制备

分别将三种低聚糖用732型阳离子氢型树脂在4℃下交换1 h，过滤，再用四丁基氢氧化铵调节溶液pH值至6.0，冻干，得两种卡拉胶四丁基铵盐。将1 g卡拉胶四丁基铵盐溶于25 mL N，N-二甲基甲酰胺，在60℃搅拌30 min，再依次加入0.160 g催化剂4-二甲基氨基吡啶，6.5 mL三丁基胺，4.8 g酰化剂邻苯二甲酸酐，在60℃下搅拌，通N2反应12 h。所得产物在4℃用三水合乙酸钠的过饱和乙醇溶液沉淀1 h，用无水乙醇洗涤离心3次，将沉淀溶于蒸馏水中，在5%NaHCO3溶液中透析2 d，然后在蒸馏水中透析4 d，冻干后分别得三种卡拉胶邻苯二甲酰基化产物(LA、LB和LC)1.0 g［6］。

1.4 测试表征

红外光谱在EQUNOX55傅立叶红外-拉曼光谱仪上进行，采用KBr压片法制样，测定波数范围为400～4000 cm-1，分辨率为0.8 cm-1。

采用GPC法测定卡拉胶酰化衍生物的相对平均分子质量及其分布。GPC测试条件如下:流动相:0.1 mol/L硝酸钠水溶液;监测器:Waters 2410示差折光监测器;柱子:Ultrahygrogel 500，120串连;温度:40℃。标准物质为:葡聚糖。

1.5 取代度测定

采用盐酸羟肟比色法对κ-卡拉胶邻苯二甲酰衍生物的取代度进行测定［7］。取2.0 mL邻苯二甲酰衍生物的四氢呋喃溶液，加入1.0 mL中性羟胺溶液，于25℃水浴中静置20 min。在室温用0.3%氯化铁溶液稀释到10.0 mL，混匀，在530 nm处测定吸光度。以邻苯二甲酸酐作为标准溶液绘制标准曲线。对吸光度与浓度作图可得吸光度与邻苯二甲酸酐浓度的直线方程，利用该方程与衍生物的吸光度值可以求得衍生物的酰化取代度(DS)。

1.6 对羟基自由基·OH的清除

用pH=7.40的0.05 mol/L KH2PO4-NaOH缓冲溶液分别配制浓度为6.4×10-4mol/L的鲁米诺溶液、0.012 mol/L H2O2和0.8 mg/mL亚铁氰化钾溶液。以缓冲液作为溶剂，配制成系列不同浓度的样品溶液。用流动注射化学发光分析仪依次测定从稀到浓的样品溶液，读出峰面积。清除率=(A0-Ai)/A0×100%。式中A0为空白溶液峰面积;Ai为样品溶液峰面积。经SOD，过氧化氢酶及甘露醇检测，该体系产生的自由基为羟基自由基·OH［8］。

1.7 对DPPH自由基的清除

在装2.0 mL浓度为1×10-4mol/LDPPH无水乙醇溶液的比色管中，加入不同浓度的样品溶液2.0 mL，摇匀，33℃避光静置半小时，在517 nm处测量吸光度Ai。用去离子水代替样品溶液，得吸光度A0，无水乙醇代替DPPH，得吸光度Aj，清除率=［1-(Ai-Aj)/A0］×100%［9］。

1.8 对过氧化氢的清除

配制pH=7.2的0.2 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液，用缓冲溶液配制0.1 mol/L的H2O2溶液，在装有此H2O2溶液的比色管中，加入不同浓度的样品溶液2.0 mL，摇匀，33℃避光静置半小时，在230 nm处测量吸光度Ai。用去离子水代替样品溶液，得吸光度A0，去离子水代替H2O2溶液，得吸光度Aj。清除率=［1–(Ai-Aj)/A0］×100%。

1.9 还原能力的测定

还原能力根据文献［10］测定并稍做改进。取2.0 mL不同浓度的样品，加入pH=6.60的0.2 mol/L磷酸缓冲液和1%铁氰化钾溶液各2.5 mL，混匀，50℃水浴20 min后迅速冷却，加入 2.5 mL10%三氯乙酸溶液，混匀后在2000 r/min下离心10 min，取上清液2.0 mL，加入2.5 mL去离子水和0.5 mL 0.1%的三氯化铁溶液，静置十分钟后在700 nm处测定吸光度。

2 结果与讨论

2.1 低分子量κ-卡拉胶邻苯二甲酰衍生物的结构表征

图1为原料卡拉胶(KC)及三种不同分子量卡拉胶邻苯二甲酰基化衍生物(LA、LB和LC)的红外光谱图。从图中可以看出，卡拉胶邻苯二甲酰衍生物保留有原料卡拉胶的三个特征吸收峰［3］，即1280 cm-1吸收峰处的O-S-O对称伸缩振动吸收峰;840 cm-1吸收峰处的C-O-S伸缩振动吸收峰;930 cm-1吸收峰处的3，6-内醚-D-半乳糖中C-O-C的伸缩振动吸收峰，这表明卡拉胶经过邻苯二甲酰基化后，其结构单元未发生变化。卡拉胶邻苯二甲酰衍生物在1720、1590、1570 cm-1和1450 cm-1处出现特征吸收峰，1720 cm-1吸收峰归属于经邻苯二甲酸酐酰化后形成的酯基的特征吸收;而1590、1570 cm-1和1450 cm-1处则为苯环的特征吸收峰，这些测试表明邻苯二甲酰基被成功地引入到卡拉胶低聚糖分子上［4］。

GPC结果及取代度测试结果表明:卡拉胶原料(KC)及三种衍生物(LA、LB和LC)的平均相对分子质量分别为:3.5×105、1450、2520和3430;而其邻苯二甲酰基取代度分别为:0.44、0.29和0.37。

图1 原料卡拉胶及酰化衍生物的红外光谱图Fig.1 FI-IR spectra of κ-carrageenan polysaccharide and the acylated derivatives

2.2 对羟基自由基·OH的清除

图2描述了不同分子量κ-卡拉胶邻苯二甲酰衍生物(LA、LB和LC)对羟基自由基·OH的清除效果。它们对羟基自由基·OH的清除活性随着浓度的升高而逐渐增强，LA和LC对于羟基自由基·OH的半抑制浓度IC50(对自由基清除率为50%时所需要的自由基清除剂浓度)分别为4.47 mmol/L和2.19 mmol/L，而LB在测试浓度范围内未能达到半抑制。表明其对羟基自由基·OH清除能力的强弱顺序为:LC＞LA＞LB。

图2 卡拉胶酰化衍生物对羟基自由基的清除Fig.2 Scavenging abilities of the acylated derivatives on hydroxyl radicals

2.3 对DPPH自由基的清除

图3描述了不同分子量κ-卡拉胶邻苯二甲酰衍生物(LA、LB和LC)对DPPH自由基的清除效果。它们对DPPH自由基的清除活性随着浓度的升高而逐渐增强，其对于DPPH自由基的半抑制浓度IC50分别为0.32、0.41和0.23 mmol/L。即对DPPH自由基清除能力的强弱顺序为:LC＞LA＞LB。

图3 卡拉胶酰化衍生物对DPPH自由基的清除Fig.3 Scavenging abilities of the acylated derivatives on DPPH radicals

2.4 对过氧化氢的清除

图4描述了不同分子量κ-卡拉胶邻苯二甲酰衍生物(LA、LB和LC)对过氧化氢的清除效果。它们对过氧化氢的清除活性随着浓度的升高而逐渐增强，当浓度为0.05 mmol/L时，其对过氧化氢的清除率分别为13.8%、7.9%和31.0%。即其对过氧化氢清除能力的强弱顺序为:LC＞LA＞LB。

图4 卡拉胶酰化衍生物对过氧化氢的清除Fig.4 H2O2scavenging abilities of the acylated derivatives

图5 卡拉胶酰化衍生物的还原能力Fig.5 Reducing power of the acylated derivatives

2.5 还原能力

图5描述了不同分子量κ-卡拉胶邻苯二甲酰衍生物(LA、LB和LC)的还原能力。由图可知，随着浓度的增加，样品的吸光值也随之增加，还原能力逐渐增强。在4.0 mmol/L时，其吸光度分别为0.734、0.619和0.898。即其还原能力的强弱顺序为:LC＞LA＞LB。

综上所述，不同分子量κ-卡拉胶邻苯二甲酰衍生物对羟基自由基·OH、DPPH自由基和过氧化氢的清除活性以及还原能力的强弱顺序为:LC＞LA＞LB。天然多糖的抗氧化活性与其分子中的羟基含量有关［11，12］。κ-卡拉胶结构单元的分子量是373，其中含有3个羟基。由于LA、LB和LC的酰化取代度分别为0.44，0.29和0.37。可知:一个LA分子平均含有5.6个羟基，一个LB分子平均含有12.9个羟基，而一个LC分子平均含有15.2个羟基，三种衍生物的羟基含量大小顺序为:LC＞LB＞LA。

邻苯二甲酰基通过取代羟基而接枝在分子上，卡拉胶经过邻苯二甲酰化后引入了吸电子基团—CO-C6H4-COO-，由于其吸电子作用可能使母体卡拉胶分子的电子云密度降低，使得O-H键更易断裂，提高了剩余羟基中氢的活性，给电子能力提高并且更易与自由基反应，从而使其抗氧化活性增强，由此可能使得取代度越高，抗氧化能力越强。三种衍生物的取代度大小顺序为:LA＞LC＞LB。不同分子量邻苯二甲酰基化卡拉胶的抗氧化活性可能主要是分子中羟基含量、邻苯二甲酰基性质以及其取代度等因素协同作用的结果。LC含有的羟基数目最多，而LA酰化取代度最大，但导致上述结果的原因仍需进一步研究。

3 结论

HCl水解法制备卡拉胶低聚糖，经过透析，制备三种不同分子量的低聚糖，进一步进行邻苯二甲酰基化得到三种不同分子量的衍生物。抗氧化性能测试表明，三种衍生物抗氧化能力的强弱顺序为LC＞LA＞LB。抗氧化活性可能与衍生物的分子量、分子中的羟基含量以及酰化取代度大小有关。本研究为κ-卡拉胶的高值化利用和海洋多糖类药物的研究提供有益的参考。

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Antioxidant Activity of Phthaloyl Derivative of κ-Carrageenan Oligosaccharides

SUN Tao*，TAO Hui-na，ZHOU Dong-xiang，MAO Fang，XIE Jing
College of Food Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China

Three κ-carrageenan oligosaccharides were prepared by acidic degradation of κ-carrageenan.Their phthaloyl derivatives with different molecular weight(LA∶1450;LB∶2520;LC∶3430)were synthesized with phthalic anhydride.The products were characterized by FI-IR，and the degrees of acylation(DS)were determined.Their antioxidant activities were evaluated by the scavenging of hydroxyl radical，1，1-diphenyl-2-picrylhrazyl radicals(DPPH)，hydrogen peroxide and reducing power.The results indicated that the orders of antioxidant activities were:LC＞LA＞LB.It may be related to the content of hydroxyl groups，the nature of substituting group and the substituting degrees.

κ-carrageenan;acid degradation;phthaloyl;antioxidant activity

1001-6880(2011)03-0530-04

2009-10-30 接受日期:2010-01-22

上海市教委重点学科建设项目(J50704)，上海市生物医药和农业科技领域重点科技项目(08391911500)，2009年上海市优秀学科带头人计划(09XD1402000)。

*通讯作者 Tel:86-21-61900363;E-mail:taosun@shou.edu.cn

R285;Q539;TS202.3

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