青藤碱对MsPGN大鼠肾脏病理及ICAM-1表达的影响

2011-11-23 16:25仇新军闫翠环陈志强
天然产物研究与开发 2011年3期
关键词:青藤系膜毛细血管

方 敬,仇新军,闫翠环,陈志强

河北医科大学中西医结合研究所,石家庄050017

青藤碱对MsPGN大鼠肾脏病理及ICAM-1表达的影响

方 敬,仇新军,闫翠环,陈志强*

河北医科大学中西医结合研究所,石家庄050017

为探讨青藤碱(Sinomenine,SIN)对实验性系膜增生性肾小球肾炎(MsPGN)的病理形态学改善及肾组织中细胞间粘附分子-1(ICAM-1)表达的影响,通过实验建立改良的慢性血清病性MsPGN动物模型,光镜观察肾小球以及肾小管-间质的病理改变情况,采用免疫组织化学法检测ICAM-1的表达并分别进行半定量分析。结果显示:光镜下,模型组与正常组相比,系膜基质指数显著升高(P<0.01),肾小球毛细血管直径明显缩小(P<0.01);青藤碱组与模型组相比,上述病理改变明显减轻,系膜基质指数显著下降(P<0.01),肾小球毛细血管直径明显改善(P<0.01)。肾组织中ICAM-1免疫组化结果显示青藤碱可明显 下调ICAM-1的表达,肾组织ICAM-1的相对含量、积分光密度,均显著下降(P<0.01),青藤碱组与雷公藤多苷组相比,二者无统计学意义(P>0.05)。实验表明青藤碱能够有效减轻肾脏病理损害,抑制MsPGN大鼠肾组织ICAM-1的表达,延缓疾病进展。

青藤碱;系膜增生性肾小球肾炎;细胞间粘附分子-1

系膜增生性肾小球肾炎(mesangial proliferative glomerulonephritis,MsPGN)是以系膜细胞(mesangial cells,MC)增生和系膜区细胞外基质(extracellular matrix,ECM)聚积和扩增为主要病理改变的一类肾小球疾病,在我国约占原发性肾小球疾病肾活检病理的一半[1],多见于16~30岁的儿童和青年人。目前,西医主要采用免疫抑制剂和细胞毒药物治疗,临床疗效不理想,因此,开展MsPGN的研究,积极寻找抑制MC增生和ECM聚积的药物,对延缓肾小球疾病进展、防止肾衰具有重要的意义。

本实验旨在通过观察青藤碱对MsPGN大鼠肾脏病理形态学的影响,明确青藤碱在MsPGN病理过程中的干预作用,并通过观察与MsPGN病理改变过程有密切关系的细胞间粘附分子-1(Intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)的表达情况,探讨青藤碱防治MsPGN的部分作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

清洁级健康雄性SD系大鼠共40只,体重130~170 g,由河北医科大学实验动物中心提供,合格证号:冀医动管字第04057。

1.2 试剂

兔抗大鼠ICMA-1多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司,批号BA0541);SP(二抗为羊抗兔)试剂盒(北京中山生物技术有限公司,批号SP9001)。DAB显色剂(北京中山生物技术有限公司,批号ZLI9032)其余试剂均为国产分析纯。

1.3 模型制备

动物随机分为4组,每组10只,分别为正常组、模型组、青藤碱组和雷公藤多苷组,采用改良的慢性血清病性MsPGN模型,10%的水合氯醛麻醉后,经背部切除左侧肾脏,休养一周后,进行预免疫,于每只大鼠背部皮下分点注射完全弗氏佐剂0.1 mL加牛血清白蛋白(BSA)3.0 mg,于第1、2周末背部皮下注射不完全弗氏佐剂0.1 mL加BSA 3.0 mg,3周后腹腔注射BSA连续4次,每次间隔1 h,注射剂量每只分别为0.5、1、1.5、3.0 mg,次日每只腹腔注射BSA 2.0 mg。第4周正式免疫:尾静脉与腹腔注射隔日进行,每只大鼠尾静脉注射BSA剂量从0.5 mg开始,每次注射增加0.5 mg,至2.5 mg为止,继续每周加量0.5 mg,至每日用量5.0 mg为止,腹腔注射量是尾静脉注射量的1倍,至每日用量10.0 mg为止,免疫两周后尾静脉注射大肠杆菌内毒素(LPS) 100 ug/只,全部大鼠于正式免疫8周后处死取肾组织。

1.4 实验用药及方法

采用直接灌胃方法,于实验第4周开始灌胃给药,每日1次,青藤碱组采用正清风痛宁(白云山正清制药股份有限公司,批号:9911105),服药量为30 mg/Kg.d,按成人/Kg.d剂量的15倍给药;雷公藤多苷组采用雷公藤多苷片(湖南省株洲市制药三厂,批号:Z43020138)服药量为20 mg/Kg.d,按成人/Kg.d剂量的15倍给药,正常组灌以相应量的自来水。各组灌胃共4周。

1.5 肾组织标本制作及观察

1.5.1 光镜

实验第8周末,无菌下取右肾组织,HE、PAS染色,镜下观察拍片,并进行半定量分析。取PAS染色的肾组织切片,置于显微镜下,使用HPIAS-2000型全自动彩色图象分析系统进行分析。测定方法,每组随机选取6只大鼠的PAS切片,将PAS染色切片镜下放大400倍,每张切片至少选取20个肾小球进行测量。测定参数为肾小球面积、系膜区面积以及毛细血管腔直径,然后求出系膜区面积与肾小球面积的百分比(此值为肾小球系膜基质相对面积,也称系膜基质指数),以及肾小球毛细血管腔直径均值。

1.5.2 免疫组织化学染色

采用SABC法观察肾小球中ICMA-1的变化,并进行半定量分析。肾小球内表达:采用HMIAS-2000型高清晰度彩色病理图象分析系统,在400倍光镜下测量每个肾小球的面积以及阳性染色面积和染色强度(积分光密度)。用阳性染色面积和肾小球面积的百分比表示该成分的相对含量。每组选取6只大鼠标本,每个标本测量10个完整肾小球进行半定量分析。肾小管的表达:选用标本数及分析系统同上。检测每张切片10个视野,计算每个视野阳性染色面积以及显示屏面积,阳性染色面积和显示屏面积的比值为相对含量。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 光镜观察结果

正常组肾小球结构正常,肾小球毛细血管腔开放,系膜无增生,肾小管及间质无异常。模型组的多数肾小球系膜区明显增宽,有的肾小球毛细血管腔受压变窄或闭塞,甚至个别肾小球萎缩纤维化。部分肾小管上皮细胞肿胀、管腔狭窄,间质有炎细胞浸润。青藤碱组和雷公藤多苷组肾小球系膜区的宽度明显小于模型组,肾小球毛细血管腔呈开放状态。两治疗组肾小管及间质均无明显异常。肾小球毛细血管基底膜在光镜下观察,四组均无明显的变化。

2.2 肾组织病理形态半定量图像分析结果(见表1)

2.2.1 各组大鼠肾小球系膜基质指数的比较

结果显示:模型组与正常组比较,系膜基质指数显著升高(P<0.01),青藤碱组和雷公藤多苷组与模型组相比,系膜基质指数明显下降(P<0.01),青藤碱组和雷公藤多苷组相比,无明显差异(P>0.01)。

2.2.2 各组大鼠肾小球毛细血管腔直径的比较

结果显示:模型组与正常组比较,肾小球毛细血管腔直径显著缩小(P<0.01),青藤碱组和雷公藤多苷组与模型组相比,肾小球毛细血管腔直径明显大于模型组(P<0.01),青藤碱组和雷公藤多苷组之间无显著性差异(P>0.05)见表1。

表1 各组大鼠肾小球系膜基质指数和肾小球毛细血管腔直径的比较(±s,n=6)Table 1 Comparison of the mesangial matrix index and capillary lumen diameter(±s,n=6)

表1 各组大鼠肾小球系膜基质指数和肾小球毛细血管腔直径的比较(±s,n=6)Table 1 Comparison of the mesangial matrix index and capillary lumen diameter(±s,n=6)

注:与正常组比较△P<0.05,△△P<0.01;与模型组比较 *P<0.05,**P<0.01。下同。Note:△P<0.05,△△P<0.01 vs normal group;*P<0.05,**P<0.01 vs model group.The same below.

组别Group系膜基质指数Mesangial matrix index(%)毛细血管腔直径Capillary lumen diameter(μm) Normal 6.28±1.61 14.17±1.12模型组Model 32.46±4.63△△ 9.16±0.88△△青藤碱组SIN 20.66±1.64△△** 12.12±0.52**雷公藤多苷组TWP 20.37±1.42△△** 12.16±0.78正常组△△**

2.3 免疫组化检验结果

2.3.1 各组大鼠肾组织ICAM-1表达及其分布

正常组ICAM-1分布很少,仅少量表达,着色浅淡。与正常组相比,模型组ICAM-1表达的范围和强度明显扩大和增强,主要分布在肾小球系膜细胞、肾小球的血管内皮细胞、某些肾小囊的上皮细胞及小管间质部位,呈棕黄色颗粒,表达较强。与模型组相比,两治疗组表达降低,呈中度表达。

2.3.2 各组大鼠肾组织ICAM-1半定量分析:

青藤碱组和雷公藤多苷组与模型组相比相对含量、积分光密度,均显著下降(P<0.01),提示青藤碱组和雷公藤多苷组均可抑制MsPGN肾小球ECM中ICAM-1的过度表达;青藤碱组和雷公藤多苷组比较,ICAM-1的表达不论是相对含量、还是积分光密度,均无显著性差异(P>0.05),见表2和3。

3 讨论

我们选用邹氏造模法并进行改良制备MsPGN模型[2],实验结果表明,青藤碱可以抑制肾小球系膜细胞增殖,系膜基质积聚,延缓病变进展,其作用机制可能与该药抑制ICAM-1的表达有关。

表2 肾小管中ICAM-1的相对含量、积分光密度的半定量分析(±s,n=6)Table 2 Comparison of relative amount and density of ICAM-1 in renal tubule(±s,n=6)

表2 肾小管中ICAM-1的相对含量、积分光密度的半定量分析(±s,n=6)Table 2 Comparison of relative amount and density of ICAM-1 in renal tubule(±s,n=6)

积分光密度相对含量Relative amount(%)组别Group Normal 1.11±0.50 1.37±0.52模型组Model 12.11±3.76△△ 5.67±0.72△△青藤碱组SIN 5.74±1.38△△** 4.32±0.44△△*雷公藤多苷组TWP 5.32±1.11△△** 3.81±0.37 Density正常组△△**

表3 肾小球中ICAM-1的相对含量、积分光密度的半定量分析(±s,n=6)Table 3 Comparison of relative amount and density of ICAM-1 in glomerulus(±s,n=6)

表3 肾小球中ICAM-1的相对含量、积分光密度的半定量分析(±s,n=6)Table 3 Comparison of relative amount and density of ICAM-1 in glomerulus(±s,n=6)

积分光密度Normal 1.09±0.27 1.00±0.28模型组Model 10.03±2.99△△ 5.22±0.84△△青藤碱组SIN 4.52±0.64△△** 3.63±0.63△△*雷公藤多苷组TWP 4.68±0.55△△** 3.49±0.55 Density正常组组别Group相对含量Relative amount(%)△△**

ICAM-1与肾脏炎性病变有着密切关系,在生理情况下,ICAM-1通常以低水平表达于肾脏大血管的内皮细胞、包曼氏囊上皮细胞、肾小球系膜细胞、肾小管周围毛细血管内皮细胞,偶见于间质细胞[3],也有认为肾小管间质无表达[4]。当发生免疫反应时,受各种刺激因素包括维甲酸、病毒感染、氧应急、内毒素、和多种致炎因子如白介素-1、肿瘤坏死因子和干扰素等均可上调ICAM-1的表达,通过ICAM-1与淋巴细胞功能相关抗原(lymphocytefunctionassociatedantigen-1,LFA-1)等的相互作用,导致淋巴细胞、巨噬细胞与高表达ICAM-1的各种内皮/上皮细胞发生粘附,使炎症细胞粘附并进一步移入组织,引起一系列的炎症免疫反应。研究已证明[5]在非IgA系膜增生性肾小球肾炎和IgA肾病的肾脏病理活检标本中,ICAM-1的表达弥散分布于系膜区,广泛分布于肾小管周围毛细血管的内皮细胞、间质细胞、浸润的炎症细胞和肾小管的上皮细胞中,特别在病变的肾小管上皮细胞上表达强烈,并且在肾小球和肾小管间质中,淋巴细胞功能相关抗原阳性细胞数量的增多与ICAM-1的表达明显相关,与肾小球和肾小管间质中浸润的单核细胞、巨噬细胞的数量明显相关。孙艳玲等[6]实验结果表明肾缺血再灌注后ICAM-1在肾小球毛细血管、系膜区及间质中大量表达。

本实验结果证实在正常大鼠肾组织中,ICAM-1分布很少,在MsPGN大鼠肾组织中,ICAM-1主要分布于肾小球系膜细胞和毛细血管内皮细胞,在肾小管间质部位也有大量表达,呈棕黄色颗粒,青藤碱组的染色面积与模型组相比有明显差异,能明显减少MsPGN大鼠肾组织中的阳性表达,提示青藤碱确实有效减缓MsPGN大鼠肾脏炎症反应。

综上所述,青藤碱通过下调ICAM-1的表达,从多种途径作用于肾组织,改善MsPGN大鼠肾脏病理改变,保护肾功能,而且毒副作用小,值得进一步研究开发利用。

1 Lu ZY(陆再英).Internal Medicine(内科学).Beijing:People’s Medical Publishing House,2001.534-535

2 Jia H(贾慧),Zou WZ(邹万忠).An improved animal model for mesangioproliferative giomerulonephritis in rat.Chin J Nephrol Dial Transplant(肾脏病与透析肾移植杂志),1996,534(3):21-25.

3 Zhang SH(张舜华).ICAM-1 and diabetes nephrosis.Foreign Med Sci(Urol Nephrol Foreign Med Sci)(国外医学·泌尿系统分册),2005,25:700-703.

4 Zhao JH(赵佳慧).ICAM-1 and kidney disease.Foreign Med Sci(Urol Nephrol Foreign Med Sci)(国外医学泌尿系统分册),2003,23:102-105.

5 Shida-Y,Oda-H,Yorioka-N.Tumor necrosis factor-alpha and IgA nephropathy.Kidney Int,1999,71(5):1-3.

6Sun YL(孙艳玲),Wu WZ(吴五洲),Liu XY(刘先义),et al.Effects of shenfu injection on expression of NF-κB,TNF-α and ICAM-1 after renal ischemia reperfusion in rats.Chin J Clin Pharm Ther(中国临床药理学与治疗学),2008,13: 1005-1009.

Affection of Sinomenine on the Kidney Pathology and Expression of ICAM-1 in the Rats with Mesangial Proliferative Glomerulonephritis

FANG Jing,QIU Xin-jun,YAN Cui-huan,CHEN Zhi-qiang*
Institution of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine,Hebei Medical University,Shijiazhuang 050017,China

To explore affection of Sinomenine(SIN)on the kidney pathology and Intercellular cell adhesion molecule-1 (ICAM-1)expression in rats with mesangial proliferative glomerulonephritis(MsPGN).The test uses the improvement chronic serum sickness nature MsPGN model,with the light mirror observing mesangial region and kidney tubules-mesenchyma,using immunohistochemical method observe the expression of ICAM-1,at the same time,carries on the semidefinite quantity analysis with the pathology image analysis system.The results showed that compared with the normal group,mesangial matrix index(%)remarkably heighten(P<0.01)and capillary lumen diameter(μm)obviously reduce.Compard with the model group,in SIN group,mesangial matrix index(%)remarkably reduce(P<0.01)and capillary lumen diameter(μm)obviously improve(P<0.01).In the nephridial tissue immunohistochemistry result showed that SIN can obviously reduce Relative amount(%)and Density expression(P<0.01).Comparing between two treatments groups,although the result of SIN group is lower than TWP group but the two comparison have no the remarkable difference(P>0.05).This result suggested that SIN can effectively reduce the kidney pathological lesion,refrain the expression of ICAM-1.

sinomenine;mesangial proliferative glomerulonephritis(MsPGN);Intercellular cell adhesion molecule-1 (ICAM-1)

1001-6880(2011)03-0436-04

2010-08-31 接受日期:2010-12-24

河北省中医药管理局课题(2009001)

*通讯作者 Tel:86-311-86265113;E-mail:fangjing1102@126.com

R332

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