基于16S rDNA序列的2株气单胞菌属细菌的分子鉴定

谭凤霞，叶 聪 (长江大学动物科学学院， 湖北 荆州 434025)

基于16S rDNA序列的2株气单胞菌属细菌的分子鉴定

谭凤霞，叶 聪 (长江大学动物科学学院， 湖北 荆州 434025)

对分离自患病鲫鱼的2株气单胞菌的16S rDNA序列进行PCR扩增并测定其核酸序列，通过NCBI的BLAST查找同源序列，应用MegAlign采用Jotun Hein、ClustalV以及ClustalW 3种方法分别进行序列比对，并利用Mega4.0软件采用邻接法(N-J)、最小进化法(ME)、最大简约法(MP)、非加权组平均法(UPGMA)构建系统发育树。3种序列比对结果显示，Aeromonassp.T1与Aeromonassp.T2序列具有较高的相似度，分别为97.5%(Jotun Hein)、96%(ClustalV)、96.4%(ClustalW)；Aeromonassp.T1与Genebank登录号为HM778461.1序列相似度最高，分别为97.1%(Jotun Hein)、93.8%(ClustalV)、94.5%(ClustalW)；Aeromonassp.T2与同样与Genebank登录号为HM778461.1序列相似度最高，分别为97.7%(Jotun Hein)、95.3%(ClustalV)、96.8%(ClustalW)。4种方法构建的系统发育树基本一致，可初步确立2株菌株的分类地位：Aeromonassp.T1、Aeromonassp.T2与登录号为HM127065.1的菌株的聚为一类，亲缘关系最近。

气单胞菌(Aeromonas)；16S rDNA；分子鉴定

气单胞菌属(Aeromonas)曾与弧菌属(Vibrio)、原细菌属(Protobacterium)和邻单胞菌属(Plesiomonas)被归入弧菌科(Vibrionaseae)[1]。随着现代分子遗传学的发展，以往被归类为弧菌科的气单胞菌属划为一个独立的科，即气单胞菌科。到目前为止该项包括：嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、豚鼠气单胞菌(Aeromonascaviae)、温和气单胞菌(Aeromonassobria)、维隆气单胞菌(Aeromonasveronii)、杀鲑气单胞菌(Aeromonassalmonicida)、中间气单胞菌(Aeromonasmedia)、嗜矿泉气单胞菌(Aeromonaseucrenophila)、简氏气单胞菌(Aeromonasjandaei)、鳗鱼气单胞菌(Aeromonasichthiosmia)、舒氏气单胞菌(Aermonasschubertii)、尺骨气单胞菌(Aeromonastrota)、气单胞菌群501、异常嗜糖气单胞菌(Aeromonasallosaccharophila)和斑点气单胞菌(Aeromonaspunctata)共14 个气单胞菌表型种和16个基因种[1,2]。

细菌分类鉴定方法包括表型鉴定法和分子遗传学鉴定法2大类，分成4个水平细菌形态和生理生化水平、细胞组分水平、蛋白质水平和核酸水平。表型鉴定法是对前3个水平的鉴定，包括常规鉴定法、数值分类鉴定法和化学分类鉴定法[3]。分子遗传学鉴定法是核酸水平的鉴定，对细菌染色体或质粒DNA进行分析，包括G + C含量测定、核酸杂交、PCR 技术、16S rRNA 和16～23S rRNA序列分析、全基因组测序等。其中16S rRNA/rDNA 序列分析技术是分子生态学领域的一项重要技术，目前已被广泛应用于微生物的分类、鉴定以及微生物的群落研究，由于该技术具有方便、准确、快捷等特点，在鉴定土壤样品中的细菌[4]、动物内脏及肠道中的菌落[5]、野生菌株的归属[6]、致病菌的快速鉴定[7]等方面得到了广泛的应用。

本研究对分离自患出血病鲫鱼的肠道和腹水中的2株气单胞菌属细菌Aeromonassp.T1和Aeromonassp.T2进行16S rDNA基因的序列进行序列同源性和聚类分析，以鉴定其分类地位，为进一步应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 菌株

气单胞菌菌株Aeromonassp.T1和Aeromonassp.T2分离自患病鲫鱼(Carassiusauratusgibelio)。

1.1.2 主要试剂

溴化乙锭(EB)、dNTP(10mmol/L)、溴酚蓝、Tris碱、EDTA等购自Amresco公司；Taq酶购自Fermentas公司；DNA Mark、DNA 提取试剂盒购自TOYOBO公司；琼脂糖购自Biowest公司；牛肉膏、胰蛋白胨、琼脂粉、冰醋酸、NaCl等为国产分析纯试剂。

1.2方法

1.2.1 细菌的培养

4℃斜面保存的菌株涂布于平板，28℃培养24h，用生理盐水洗下菌苔制成菌悬液。

1.2.2 细菌基因组DNA的提取

按照DNA提取试剂盒的说明书提取基因组DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量。

1.2.3 16S rDNA基因片段的扩增

采用16S rDNA细菌通用引物：8f: 5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’；1492r: 5’-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’。聚合酶链反应(PCR)按以下次序，将各成分在0.5ml无菌PCR管内混合，总体积25μl：PCR buffer(10×，2.5μl)、MgCl2(25mmol/L，1.5μl)、dNTPs(2mmol/L，2.0μl)、上游和下游引物(10μmol/L，各0.5μl)、模板DNA(0.3～0.4μg)、Taq-DNA (1U/μl，0.5μl)，最后补加灭菌ddH2O至25μl。 短暂离心(8000r/min，10s)混匀，每管加入30μl液体石蜡油覆盖于反应混和液上，将样品置于PCR合成仪中按以下条件进行PCR扩增反应：94℃预变性2min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃保温8min。末轮循环后一直维持在4℃，扩增产物置于-20℃备用。

扩增得到的产物用1.5%琼脂糖凝胶(含溴化乙锭1mg/L)在5V/cm的电压下电泳。电泳结束后，用凝胶成像系统照相，观察到所需产物的扩增带后，送上海生工武汉测序部进行产物纯化和正反测序。

1.2.4 数据分析

采用ContigExpress软件进行序列拼接得到其16S rDNA基因全序列， BLAST相似序列，以MegAlign软件比较这些序列的差异和相似度。用ClustalX软件排列比对序列，用Mega4.0软件分别进行、邻接法(N-J)、最小进化法(ME)、最大简约法(MP)、非加权组平均法(UPGMA)构建系统发育树，其中自举检验1000个副本。

2 结果与分析

2.1PCR产物扩增结果

按照1.2.2的方法提取得到各菌株的总DNA，电泳检测无拖尾现象,表明质量较高(图1)，可直接用于PCR反应。以16S rDNA的通用引物(8f，1492r)，扩增得到的片段大小为1500bp左右，符合预期大小，扩增特异性较高(图2)。

图1 DNA电泳图 图2 PCR扩增产物电泳图

2.2目的基因测序结果

以通用引物作为测序引物，对PCR产物进行双向测序，所得测序峰图中大多数碱基峰清晰，杂峰较少，测序起始后的前40个左右碱基峰型相对杂乱，通过ContigExpress软件进行杂峰修正和正反序列的拼接，得到2株气单胞菌属细菌的1500bp左右片段。Aeromonassp.T1和Aeromonassp.T2 DNA序列见表1。

2.3序列比对结果

以拼接后的各菌株16S rDNA序列在Genebank中进行BLASTA比对，搜索同源较近的序列，从中挑选出4个序列： Uncultured bacterium clone aaa64h02 (DQ817645.1)、Uncultured bacterium clone SINI708 (HM127056.1)、Uncultured bacterium clone JFR0501_aaa05c04 (HM778461.1)和Uncultured bacterium clone JFR0501_aaa03e08 (HM778618.1)。Megalign软件比较序列得到的同源性结果如图3～图5。3种序列比对结果显示，Aeromonassp.T1与Aeromonassp.T2序列具有较高的同源性，分别为97.5%(Jotun Hein)、96%(ClustalV)、96.4%(ClustalW)；Aeromonassp.T1与Genebank登录号为HM778461.1序列同源性最高，分别为97.1%(Jotun Hein)、93.8%(ClustalV)、94.5%(ClustalW)；Aeromonassp.T2同样与Genebank登录号为HM778461.1序列同源性最高，分别为97.7%(Jotun Hein)、95.3%(ClustalV)、96.8%(ClustalW)。

图3 Jotun Hein法基因序列比较结果

图4 ClustalV法基因序列比较结果

图5 ClustalW法基因序列比较结果

图6 N-J法构建的系统发育树

图7 ME法构建的系统发育树

图8 MP法构建的系统发育树

图9 UPGMA法构建的系统发育树

2.4构建系统发育树

以登录号为X16895.1的鳗弧菌(Vibroanguiuarum)16S rDNA序列作为属外序列，采用Mega4.0软件以4种方法构建的系统发育树基本相似(图6～图9)。初步确立两株菌株的分类地位为，Aeromonassp.T1、Aeromonassp.T2与登录号为HM127065.1的菌株的聚为一类，亲缘关系最近。

3 讨论

16S rDNA序列保守区和多变区间隔排列，选择合适的区域作为分子标记，可以用于区分不同的分类等级。以多少相似性程度作为各分类等级的划分标准应根据特定的研究对象来确定[8]。本研究中菌株16S rDNA的扩增、测序采用的是8f和1492r细菌通用引物，而其它菌株在扩增和测序时所采用的引物可能不尽相同，造成相应序列长度的差异。本研究数据分析中采用的是原始序列长度，未进行序列的人工切除，可能影响到序列比对的结果，在比对的序列中同源性100%的2对序列较少。另外本研究采用3种方法对分离株与BLAST序列进行了序列相似性的比对，结果分离株与其相似度最高的序列是一致的。而这3种序列排列方法有所不同，Jotun Hein法是根据已有的系统调整相关的序列进行比对，而其他2种方法不需要这个假设，ClustalW较ClustalV更进步，提供更准确的高度分化序列比对。因此，在本研究中应用Jotun Hein法得出的序列相似性较其他2种方法稍高。

对DNA序列进行系统发育分析的3个主要步骤是比对、建立取代模型和进化树以及进化树评估。目前建树方法主要有3类，分别是距离法(包括最小进化法和邻接法等)、最大简约法(maximum parsimon，MP)和最大似然法(maximum likelihood，ML)。距离建树法考察数据组中所有序列的两两比对结果，通过序列两两之间的差异决定进化树的拓扑结构和树枝长度；最大简约法考察数据组中序列的多重比对结果，优化出的进化树能够利用最少的离散步骤去解释多重比对中的碱基差异；最大似然法考察数据组中序列的多重比对结果，优化出拥有一定拓扑结构和树枝长度的进化树，这个进化树能够以最大的概率导致考察的多重比对结果。这3种建树方法由于各自的局限性均可能导致系统误差的产生[9]，为了尽量避免误差的影响，本研究同时采用了3类方法，通过比较它们所构建的系统进化树，来综合分析系统发生关系。可见4种方法建立的系统发育树基本一致，本研究所构建的系统发育树是可信的，各分离菌株的最近亲缘关系菌株也是可信的。

本研究中BLAST查找同源性较高的条序列均为不可培养细菌克隆的序列，不可培养微生物的概念是1982年Colwell 实验室提出的概念，他们发现将霍乱弧菌和大肠埃希菌(简称大肠杆菌)转到不含营养物质的盐水中，经常长时间的低温保存，细菌会进入一种数量不减、有代谢活力、但在正常试验室培养条件下不能生长产生菌落的状态，称为活的但不能培养(viable but nonculturable，VBNC)状态。其后对多种属细菌进行试验证明，这种不可培养状态是普遍存在的。自然界中也广泛存在着这种活的但不可培养微生物，在各种生境中仅有小部分的微生物可用实验室方法分离培养，而未被培养的种类却代表了巨大的多样性[10]。本研究中的2株气单胞菌与GenBank中登录号为HM127065.1的菌株的聚为一类，亲缘关系最近。而HM127065.1的菌株为西藏湖泊中的1株不可培养细菌克隆(Uncultured bacterium clone SINI708)，由此可见，细菌未被培养的种类可在特定的环境中被分离培养。

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10.3969/j.issn.1673-1409.2011.07.118

Q939

A

1673-1409(2011)07-0257-06

2011-07-01

长江大学博士启动基金(801200010110)。

谭凤霞，女，博士，讲师，主要从事微生物学研究。