春甘蓝游离小孢子培养离体培养研究初报

付明星 (长江大学园艺园林学院，湖北 荆州 434025；襄樊学院理工学院，湖北 襄阳 441003)

刘乐承，林小芳，孙 贺 (长江大学园艺园林学院，湖北 荆州 434025)

春甘蓝游离小孢子培养离体培养研究初报

付明星 (长江大学园艺园林学院，湖北 荆州 434025；襄樊学院理工学院，湖北 襄阳 441003)

刘乐承，林小芳，孙 贺 (长江大学园艺园林学院，湖北 荆州 434025)

以春甘蓝4个基因型为试材，采用NLN-13液体培养基，研究了小孢子发育阶段、基因型、活性炭和植物生长调节剂等因素对春甘蓝小孢子培养的影响。结果表明，春甘蓝不同基因型间的小孢子胚诱导率相差很大；单核靠边期和双核期早期是诱导小孢子胚的有利时期，而双核期早期小孢子胚诱导率最高；培养基中添加活性炭有利于提高小孢子胚诱导率，而且多数品种以添加0.2g/L的活性炭为宜；试验浓度范围内的6-BA能提高小孢子胚诱导率，而且0.10mg/L 6-BA效果最好，但试验浓度范围内的NAA均表现出抑制成胚的作用。

春甘蓝；游离小孢子培养；小孢子胚诱导；发育阶段；基因型；活性炭；植物生长调节剂

甘蓝(Brassicaoleraceassp.capitata)属十字花科芸薹属，起源于欧洲地中海沿岸，是世界上栽培历史最长、面积最大的蔬菜之一[1]。甘蓝在我国南北各地普遍栽培，在蔬菜栽培中占很重要的地位[2]。近年来，由于南方地区4～6月采收的春甘蓝经济效益高，栽培面积逐渐转为最大。然而，尽管结球甘蓝生产上栽培品种已杂种化，但是杂交亲本采用常规的自交分离方法要历6～8代，而且甘蓝是绿体春化冬性较强的作物，不易加代，育种周期长，而我国的甘蓝品种选育仍然以常规方法为主，因而品种选育及品种更新工作缓慢，春甘蓝品种则更甚。采用单倍体育种技术，可在1～2a时间内得到纯合的双单倍体(doubled haploid，DH)植株，大大地提高育种效率。在单倍体育种中，由于花药培养诱导单倍体植株的频率低，能通过花药培养获得再生植株的基因型十分有限，而且花药培养时花药壁体细胞再生植株易与花粉细胞再生的植株混淆[3-4]。而游离小孢子培养(Isolated microspore culture)排除了花丝、药壁和药隔等母体组织体细胞的干扰，通过培养得到的植株100%来自小孢子群体[4]，由单倍体细胞发育而来，避免了嵌合体的发生，而且在单倍体育种效率上显示出比花药培养高得多的潜力，具有比花药培养更多的优越性。国内外已将该技术应用到油菜、甘蓝类蔬菜和秋冬大白菜等的育种中[5-8]。虽然甘蓝游离小孢子培养技术体系已初步建立[9]，但在甘蓝作物中受基因型的制约和环境的影响很大，重复性差、出胚率低，制约小孢子胚胎发生的关键因素还不十分清楚，不同研究者的报道在诸多方面甚至得出了相互矛盾的结论，培养技术还很不成熟。本研究以春甘蓝4个基因型为材料，探讨若干因素对其游离小孢子培养的影响，以期提高培养效率，为进一步获得不同基因型的DH群体及育种研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 植物材料

试验材料为‘京丰一号’、‘春丰甘蓝’、‘商甘蓝一号’和‘超级争春’春甘蓝4个基因型。在长江大学园艺园林学院教学基地提早到9月中旬播种，10月下旬定植，常规田间管理。

表1 主要培养基成分 mg/L

1.1.2 培养基

游离小孢子培养所需B5液体培养基、NLN-13液体培养基的组成如表1。

B5培养基121℃高压灭菌15min，冷却后置于4℃冰箱保存；NLN-13培养基在超净工作台上以针式过滤器抽滤灭菌，依次用0.45μm和0.22μm微孔醋酸纤维滤膜过滤后，分装至小锥形瓶中，4℃冰箱保存。醋酸洋红染色液、卡诺氏固定液、大量元素(10×)、微量元素(100×)、维生素(100×)、Fe-EDTA(100×)、0.05mg/ml的 6-苄基腺嘌呤(6-BA)、0.1mg/ml的α-萘乙酸(NAA)4℃保存。

1.2方法

1.2.1 小孢子发育时期的观察

将花蕾分为1.5～l.99、2.0～2.49、2.5～2.99、3.0～3.49、3.5～3.99、4.0～4.49、4.5～4.99mm等7个组别。每组随机取10个花蕾，置于卡诺氏固定液固定24h后，转移到70%酒精中4℃冰箱保存。制片时，用镊子从固定的花蕾中取出花药置于载玻片上，轻轻挤出花粉涂抹到载玻片上，去除花药壁等较大的组织碎片，加1滴1%的醋酸洋红染色1～2min，盖上盖玻片，烤片、压片制成临时制片，光学显微镜下观察。

1.2.2 小孢子的分离纯化

植株现蕾后，摘取健壮植株的花序，采用醋酸洋红压片后在光学显微镜下观察。选取单核靠边期至双核早期小孢子所占比例较大的花蕾，30个1组，流水冲洗30min后沥干水分，经70%乙醇溶液表面消毒30s后，用0.1% HgCl溶液消毒8min，无菌水洗涤3次，每次5min。消毒后的花蕾放入无菌小烧杯，加少量B5液体洗涤培养基，用无菌研棒碾压挤出小孢子，悬浮液用孔径40μm的尼龙网过滤，收集滤液于10ml离心管中，1000r/min下离心3min，弃上清，重复3次，所得沉淀物即为纯净小孢子。

1.2.3 游离小孢子培养

将纯化后的小孢子用NLN-13培养液稀释，保持小孢子密度1×105～2×105个/ml，以每皿2.5ml小孢子悬浮液分装入直径为60mm的无菌玻璃培养皿内，封口膜封口，33℃恒温箱中热激处理24h后，25℃下静置暗培养。小孢子培养采用NLN-13液体培养基，pH5.8，蔗糖浓度13%，添加或不添加植物生长调节剂、活性炭，用孔径0.45μm滤膜抽滤灭菌。3周后统计胚状体数目，并以公式小孢子胚诱导率=胚状体总数/30花蕾计算小孢子胚诱导率。

2 结果与分析

2.1花蕾大小与小孢子发育时期的关系

对4个基因型的花蕾染色后发现，一般在单核中早期，小孢子近似圆形；当发育到单核靠边期时，小孢子外壁逐渐形成3个明显的花瓣；而到双核期后，花瓣型逐渐向外扩展变的模糊，进而消失。进一步观察发现，花蕾大小lt;2.0mm时，单核靠边期小孢子的数量lt;50%；花蕾在2.0～3.0mm之间时，单核靠边期的小孢子则一般在50%～70%之间；花蕾大小为3.0～4.0mm之间时，10%～30%的小孢子发育到双核期；花蕾大小gt;4.0mm以后，双核期的小孢子一般gt;30%。结果表明，花蕾大小与发育时期存在一定的相关性，但不同的基因型间存在一定的差异，而且同一个花蕾中小孢子发育的时期也并非完全一致。

2.2小孢子发育时期对小孢子胚胎发生的影响

以‘商甘蓝一号’为材料，依据2.1的结果设置4种不同处理：单核靠边期小孢子lt;50%、单核靠边期小孢子50%～70%，双核期小孢子10%～30%和双核期小孢子gt;30%，采用不添加植物生长调节剂和活性炭的NLN-13液体培养基，研究小孢子发育时期对胚胎发生的影响，结果如表2。由表2可以看出，春甘蓝在双核期小孢子数量在10%～30%时，产生的胚状体最多，显著高于其他3种处理。结果表明，春甘蓝‘商甘蓝一号’在单核靠边期和双核期早期(小孢子数量在10%～30%)是诱导小孢子胚的有利时期，双核期早期小孢子胚诱导率最高。

表2 小孢子发育时期对小孢子胚胎发生的影响

2.3不同基因型间小孢子胚胎发生结果比较

为探讨不同基因型对小孢子胚发生的影响，采用不添加植物生长调节剂和活性炭的NLN-13培养基，取双核期早期的花蕾进行培养，统计结果见表3。由表3可以看出，供试的春甘蓝4个基因型间小孢子胚诱导率均有极显著差异，其中小孢子胚诱导率最高的基因型是‘超级争春’，为3.23个/蕾；最低的基因型是‘春丰甘蓝’，为0.23个/蕾。结果表明，不同的基因型间小孢子胚诱导率相差很大。

表3 基因型对小孢子胚胎发生的影响

2.4活性炭对小孢子胚胎发生的影响

在NLN-13培养基中分别添加浓度为0.2、0.4g/L的活性炭，以不添加活性炭的为对照(CK)，取春甘蓝4个基因型双核期早期的花蕾进行培养，研究活性炭对胚胎发生的影响，小孢子胚诱导率结果见表4。由表4可以看出，添加活性炭后均能显著或极显著提高春甘蓝4个基因型小孢子胚诱导率，而且‘超级争春’在活性炭添加0.4g/L时的小孢子胚诱导率极显著高于添加0.2g/L的，而另外3个基因型则活性炭添加0.2g/L时的极显著高于添加0.4g/L的。结果表明，添加活性炭后有利于提高春甘蓝小孢子的小孢子胚诱导率，而且多数品种以添加0.2g/L的活性炭为宜。

表4 活性炭对小孢子胚胎发生的影响

2.5植物生长调节剂对小孢子胚胎发生的影响

以‘超级争春’双核期早期的花蕾为材料，在NLN-13培养基中分别添加浓度为0.05、0.10、0.20mg/L的6-BA，0.2、0.5、1.0mg/L的NAA，以NLN-13培养基作为对照，研究植物生长调节剂对胚胎发生的影响，小孢子胚诱导率结果见表5。由表5可以看出，添加6-BA处理的小孢子胚诱导率都显著或极显著高于对照的，而且6-BA浓度为0.10mg/L时小孢子胚诱导率达到最高，5.20个/蕾，极显著高于其他处理的；当添加NAA时，小孢子胚诱导率都显著或极显著低于于对照的。结果表明，添加试验浓度范围内的6-BA能提高‘超级争春’的小孢子胚诱导率，而且0.10mg/L 6-BA效果最好，然而试验浓度范围内的NAA均表现出抑制成胚的作用。

表5 植物生长调节剂对小孢子胚胎发生的影响

3 讨论

3.1花蕾与小孢子发育时期的关系及其小孢子胚胎发生的影响

在芸薹属蔬菜小孢子培养中，以单核靠边期和双核早期的花粉培养效果最佳[4-5，7，10-11]。本研究发现春甘蓝的适宜培养时期为单核靠边期和双核早期，与前人研究结果一致。这可能是因为单核靠边期的小孢子正处于面临不同分裂方式和发育途径的敏感时期，所以容易诱导成功。而单核早期的小孢子则需要比较苛刻的条件才能启动雄核发育，因此难以诱导成胚。关于小孢子为何处在一定时期才能诱导成苗有2种解释。一种解释是，小孢子发育成胚状体有一个临界期，超过了这一时期胚状体就不能形成；另一种解释是，在小孢子发育过程中，花粉内源植物生长调节剂水平在不断改变，由于花粉的成熟使植物生长调节剂平衡变得不合适，或为花粉发育所必需的其他一些成分已经耗尽，从而影响了诱导率[12]。

3.2基因型对小孢子胚胎发生的影响

供体植株的基因型是影响小孢子培养的关键因素，不同基因型的植株对培养的反应不同，表现为是否诱导胚状体的生成、生成胚状体的多少，以及由胚再生成植株的能力大小。本研究春甘蓝4个基因型中，不同的基因型间小孢子胚诱导率相差很大。这与前人在甘蓝类作物中的研究结果一致[13-15]。目前关于基因型影响小孢子培养的作用机理还处于起步阶段，还需进一步的研究。

3.3活性炭对小孢子胚胎发生的影响

多数研究表明，活性炭的添加对于甘蓝类作物提高胚状体诱导率是有益的[16-17]。本研究的结果也显示，添加活性炭能够提高春甘蓝胚状体诱导率，但超过一定范围反而会抑制出胚。添加活性炭悬浮液可以显著提高产胚量，还可以促进胚向植株的分化；添加活性炭不仅不会对小孢子培养产生毒害作用，而且还可以吸附培养过程中产生的有毒物质和生长抑制物质，如酚类物质[18]。但是，可能因为活性炭不仅可以吸附培养基中的有毒物质，而且可以吸附一些必要元素和植物植物生长调节剂，如NAA、KT、铁盐鳌合物等，因此，活性炭浓度不宜太高，否则会起负作用。

3.4植物生长调节剂对小孢子胚胎发生的影响

关于外源植物生长调节剂对芸薹属植物小孢子胚胎发生和植株再生的影响还未取得一致认识。有学者发现外源植物生长调节剂有利于小白菜游离小孢子胚胎发生[19]，而另外有学者却提出，植物生长调节剂可能不是他们所研究的芸薹属作物形成小孢子胚的必要条件[20-21]。在本研究中，春甘蓝在添加0.10mg/L 6-BA时小孢子胚诱导率提高，而NAA在浓度范围内表现一定的抑制成胚作用。可能不同基因型要求的植物生长调节剂组合和浓度不尽相同[22]。

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10.3969/j.issn.1673-1409.2011.07.117

Q813.7

A

1673-1409(2011)07-0252-05

2011-04-08

湖北省自然科学基金项目(2007ABA386)；湖北省荆州市科技发展计划项目(20081P033)。

付明星，女，硕士，主要从事园艺植物生物技术研究。

刘乐承，E-mail: lchliu18@yangtzeu.edu.cn。