沙利度胺对大鼠急性坏死性胰腺炎保护作用的实验研究

祝建红 陈卫昌 叶建新

·论著·

沙利度胺对大鼠急性坏死性胰腺炎保护作用的实验研究

祝建红 陈卫昌 叶建新

目的探讨沙利度胺对大鼠急性坏死性胰腺炎(ANP)的保护作用及机制。方法54只SD大鼠按数字表法随机分成ANP组、沙利度胺组和对照组，每组18只。采用5%牛磺胆酸钠胰胆管逆行注射方法建立ANP模型。沙利度胺组于建模后1 h予沙利度胺200 mg/kg体重灌胃。术后3、6、12 h分批处死大鼠，观察腹水量；ELISA法检测血清TNF-α、IL-6、IL-18水平；流式细胞术检测外周血CD4+、CD8+T细胞比例； RT-PCR法检测胰腺组织TNF-α mRNA表达；免疫组化法检测胰腺组织细胞间黏附分子1(ICAM-1)蛋白表达；行胰腺常规病理检查。结果术后6 h，对照组的腹水量，血清TNF-α、IL-6、IL-18水平和CD4+、CD8+T细胞比例，胰腺组织TNF-α mRNA及CAM-1蛋白表达，病理评分分别为(1.03±0.31)ml、(57.17±11.29)pg/ml、(24.45±4.14)pg/ml、(64.23±21.85)pg/ml、(47.58±9.21)%、(40.88±2.96)%、0.07±0.02、0.57±0.30、0.67±0.81；ANP组分别为(3.63±0.38)ml、(107.54±33.05)pg/ml、(47.30±11.40)pg/ml、(367.76±108.43)pg/ml、(54.90±7.15)%、(17.17±3.12)%、0.65±0.26、3.20±0.57、11.50±1.87；沙利度胺组分别为(1.45±0.53)ml、(80.60±20.48)pg/ml、(26.61±10.85)pg/ml、(321.82±85.20)pg/ml、(29.80±2.19)%、(15.52±1.96)%、0.35±0.23、2.37±0.67、8.00±3.03。ANP组除CD8+T细胞比例显著降低外，其余指标均较对照组显著增加(P值均<0.05)。沙利度胺组指标均显著低于ANP组(P值均<0.05)。结论沙利度胺能通过抑制TNF-α表达，减少炎症递质的释放，从而减轻ANP大鼠的胰腺病理损害。

胰腺炎，急性坏死性； 肿瘤坏死因子α； 细胞间黏附分子； 大鼠； 沙利度胺

近年来，炎症介质和细胞因子学说在重症急性胰腺炎(SAP)发病机制中的作用越来越受到重视[1]。研究表明，急性胰腺炎(AP)本质上是全身炎症反应综合征(SIRS)[2]。TNF-α在机体的炎症反应中处于始动地位，对细胞因子的级联释放具有重要意义，起到"扳机"样作用，是评估SAP预后的主要指标[3]。沙利度胺是谷氨酸衍生物，具有免疫调节、抑制TNF-α及非特异性抗炎作用，广泛应用于多种临床免疫性疾病的治疗[4]。本实验观察沙利度胺对急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠的保护作用，探讨其作用机制。

材料及方法

一、实验动物及分组

健康SD大鼠54只，雌雄不限，清洁级，体重250～300 g，由苏州大学医学院实验动物中心提供。按数字表法随机分为ANP组、沙利度胺组和对照组。采用胆胰管逆行注入4%牛磺胆酸钠(Solarbio公司) 0.1 ml/100 g体重方法建立ANP模型。沙利度胺组于建模后1 h给予沙利度胺(25 g溶于500 ml橄榄油)200 mg/kg体重灌胃。对照组只开腹翻动胰腺后随即关腹。术后3、6、12 h每组各处死6只大鼠。心脏穿刺取血。取胰腺组织，一部分常规固定，石蜡包埋；一部分液氮冻存。

二、检测指标

1．血清TNF-α、IL-6、IL-18检测：新鲜血液经 3500 r/min 4℃离心10 min分离血浆，-20℃保存。应用ELISA法检测血清TNF-α、IL-6、IL-18水平。试剂盒均购自上海西唐生物科技有限公司，按说明书操作。

2．外周血CD4+、CD8+T细胞检测：取专用试管3支，加入大鼠外周血标本100 μl，分别加入CD3-FITC/ICOS-PE、CD4-FITC/CD8-PE单克隆双色抗体5 μl，充分混匀，室温避光下孵育15 min，然后每管加入10×FACS(红细胞裂解液)2 ml，充分混匀，室温避光下溶血10 min至完全透明，1500 r/min离心10 min，弃上清液，PBS洗涤3次，每管加入0.5 ml PBS液悬浮，混匀放置室温下，用美国Beckman公司生产的流式细胞仪测定。

3．腹水观察：开腹后观察腹水性质，用称重的无菌纱布塞入大鼠腹腔约5 min，根据纱布重量的变化大体估算腹水量。

4．胰腺组织的病理检查：观察胰腺组织大体病理变化后，石蜡包埋，常规切片、HE染色。由2位病理科医师按Schmidt等[5]描述的组织学病理分级法盲法评分。

5．胰腺组织TNF-αmRNA表达的检测：用半定量RT-PCR法检测。取液氮冻存胰腺组织，用Trizol(美国Invitrogen公司)试剂一步法抽提胰腺样品总RNA。先逆转录为cDNA，再PCR扩增。TNF-α上游序列5′-CCAACAAGGAGGAGGAGAAGT-3′，下游序列5′-GTATGAAGTGGCAAATCG-3′，扩增片段323 bp；内参β-actin上游序列5′-CACGATGGAGGGGCC-GGACTCATC-3′，下游序列5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′，扩增片段241 bp。PCR退火温度54℃，38个循环。扩增产物经电泳分离，扫描，以目的条带与β-actin条带的灰度比值作为mRNA的表达量。

6．胰腺组织细胞间黏附分子-1(ICAM-1)蛋白检测：采用常规免疫组化染色法。以细胞膜或胞质内呈现棕黄色颗粒为阳性。随机观察5个具有代表性的高倍视野，计算阳性细胞占总细胞数的百分比，<5%计0分， 5%～25%计1分， 26%～50%计2分，51%～75%计3分，>75%计4分。

结 果

一、血清TNF-α、IL-6、IL-18水平及外周血CD4+、CD8+T细胞亚群比例变化

ANP组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-18水平均较对照组明显升高；沙利度胺组大鼠血清TNF-α和IL-6水平于造模后6 h、IL-18水平于造模后12 h较ANP组明显下降(P值均<0.05，表1)。

ANP组CD4+T细胞比例在造模后3、6 h较对照组显著增高,而12 h时显著降低；CD8+T细胞比例在造模后6、12 h较对照组显著下降(P值均<0.05)。沙利度胺组CD4+T细胞比例在6 h时较ANP组显著下降，而在12 h时显著增高；CD8+T细胞在12 h时显著增高(P值均<0.05，表1)。

表1 各组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-18水平及CD4+、CD8+ T细胞亚群比例

注：与对照组比较，aP<0.05；与ANP组比较，bP<0.05

二、腹水量及胰腺病理组织学改变

对照组大鼠造模后3、6、12 h腹水量分别为(0.78±0.39)、(1.03±0.31)、(1.15±0.53)ml；ANP组分别为(2.33±0.66)、(3.63±0.38)、(5.43±1.53)ml，沙利度胺组分别为(1.78±0.45)、(1.45±0.53)、(1.53±0.60)ml。ANP组各时点均较对照组明显增加(P值均<0.05)；沙利度胺组6、12 h点较ANP组明显减少(P值均<0.05)，而与对照组无明显差异。对照组大鼠胰腺无明显病理学改变；ANP组大鼠胰腺组织大片出血坏死，小叶结构破坏，大量炎细胞浸润；沙利度胺组大鼠胰腺组织病理组织学改变较ANP组明显减轻(图1)。对照组、ANP组、沙利度胺组造模后6、12 h病理评分分别为0.67±0.82、11.50±1.87、8.00±3.03；0.50±0.55、12.00±3.23、8.23±3.25。三组间差异均具有统计学意义(P值均<0.05)。

三、胰腺组织TNF-α mRNA及ICAM-1蛋白表达的变化

ANP组各时间点大鼠胰腺组织TNF-αmRNA表达均较对照组明显增高(P<0.05)；沙利度胺组则较ANP组显著降低(P值均<0.05，表2)。ANP组各时间点大鼠胰腺组织ICAM-1蛋白表达均较对照组明显增高，而沙利度胺组6 h的ICAM-1蛋白表达较ANP组显著降低(P值均<0.05，表2)。

图1对照组(a)、ANP组(b)、沙利度胺组(c)大鼠胰腺组织病理变化(HE ×100)

组 别时点只数TNF-αmRNAICAM-1蛋白对照组3h60.05±0.020.47±0.35ANP组60.96±0.24a2.30±0.817a沙利度胺组60.31±0.15ab2.02±0.567a对照组6h60.07±0.020.57±0.294ANP组60.65±0.26a3.20±0.566a沙利度胺组60.35±0.23ab2.37±0.674ab对照组12h60.06±0.030.60±0.473ANP组60.30±0.23a2.60±0.748a沙利度胺组60.08±0.04b2.00±0.566a

注：与对照组比较，aP<0.05；与ANP组比较，bP<0.05

讨 论

TNF-α能作用于多种细胞，在细胞和亚细胞水平上激发一系列级联反应[6]。IL-6是炎症反应中的重要介质，参与急性相反应诱导ICAM-1和血管细胞黏附分子(VCAM)的表达，导致炎症进展，并且可直接作用于血管内皮细胞，使其通透性增加，导致大量炎性渗出。IL-6与TNF-α等协同，构成炎症介质网络。本实验结果显示，ANP大鼠在造模后3 h血清TNF-α水平即显著升高，胰腺组织TNF-α mRNA表达也明显增高。同时，IL-6水平随着时间的推移逐渐升高，表明TNF-α在机体的炎症反应中处于始动地位，促进炎症细胞的迁移，并刺激靶细胞产生IL-6等炎症因子，引起连锁和放大反应。

Moreira等[7]报道，沙利度胺可抑制由脂多糖(LPS)诱导的TNF-α的产生，从而抑制炎症反应。给大鼠注射致死剂量的LPS前先给予该类似物，可明显地抑制内毒素性休克。本结果显示，沙利度胺组在造模后3 h血清TNF-α水平即明显降低，6 h后IL-6水平明显降低，表明沙利度胺能抑制ANP时TNF-α的表达，进而降低IL-6分泌，从而缓解胰腺的局部炎症反应。

IL-18是由库否细胞及活化的巨嗜细胞产生，能在内毒素血症时刺激机体产生IFN-γ[8]。Ueda等[9]研究表明，IL-18在AP并发多脏器功能衰竭的患者中显著升高，阻断IL-18是治疗SAP并发多脏器功能衰竭的重要途径。本实验结果显示，沙利度胺组血清IL-18水平较ANP组下降，其中12 h时差异具有统计学意义。文献报道，IL-18的表达和ICAM-1的表达具有相关性，并参与了SAP并发多脏器功能衰竭[10]。本结果也显示沙利度胺治疗后胰腺ICAM-1表达减少，提示沙利度胺不但能抑制胰腺局部的炎症反应，还能通过抑制全身炎症反应减轻多脏器功能的损害。

Ueda等[11]研究还发现，SAP患者入院后14 d时的CD4+和CD8+T细胞数量减低和继发感染相关。本实验中，沙利度胺组12 h的CD4+和CD8+T细胞数量均较ANP组增加，表明沙利度胺对AP时的免疫紊乱具有一定的调节作用，从而减少继发感染的发生。

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[11] Ueda T,Takeyama Y,Yasuda T,et al.Immunosuppression in patients with severe acute pancreatitis.J Gastroenterol,2006,41:779-784.

2010-05-12)

(本文编辑：屠振兴)

Protectiveeffectsofthalidomideonratswithacutenecrotizingpancreatitis

ZHUJian-hong,CHENWei-chang,YEJian-xin.

DepartmentofGastroenterology,FirstAffiliatedHospitalSoochowUniversity,Soochow215006,China

Correspondingauthor:Chenwei-chang,Email：weichangchen@126.com

ObjectiveTo investigate the protective effects of thalidomide on rats with acute necrotizing pancreatitis (ANP) and its mechanism.MethodsFifty four SD rats were randomly divided into the three groups: ANP group, thalidomide group and control group with 18 rats in each group. The model of ANP was induced by retrograde injection of 5% sodium taurocholate into the bili-pancreatic duct. Rats in thalidomide group

thalidomide 200 mg/kg body weight gastric lavage 1 h after ANP induction. The rats were sacrificed 3 h, 6 h, and 12 h after ANP induction, and the amount of intraperitoneal ascites was quantified. The serum levels of TNF-α, IL-6, IL-18 were measured by ELISA. The proportion of CD4+T cell, CD8+T cell in peripheral blood was determined by flow cytometry. The expression of TNF-α mRNA in pancreatic tissue were measured by RT-PCR．The expression of ICAM-1 protein in pancreatic tissue was measured by immunohistochemistry. Pancreatic tissue underwent pathologic examination.ResultsSix hours after surgery, the amount of ascite, serum levels of TNF-α, IL-6, IL-18, CD4+T cell, CD8+T cell, pancreatic TNF-α mRNA and ICAM-1 protein expression, pathologic score in control group was (1.03±0.31)ml, (57.17±11.29)pg/ml, (24.45±4.14)pg/ml, (64.23±21.85)pg/ml, (47.58±9.21)%, (40.88±2.96)%, 0.07±0.02, 0.57±0.30, 0.67±0.81, respectively, and the corresponding values were (3.63±0.38)ml, (107.54±33.05)pg/ml, (47.30±11.40)pg/ml, (367.76±108.43)pg/ml, (54.90±7.15)%, (17.17±3.12)%, 0.65±0.26, 3.20±0.57, 11.50±1.87 in ANP group; and (1.45±0.53)ml, (80.60±20.48)pg/ml,(26.61±10.85)pg/ml, (321.82±85.20)pg/ml, (29.80±2.19)%, (15.52±1.96)%, 0.35±0.23, 2.37±0.67, 8.00±3.03. Besides the value of CD8+T cell was significantly decreased, all other values were significantly increased when compared with control group (P<0.05).ConclusionsThalidomide can decrease the release of inflammatory mediator, and reduce the pathological damage of pancreas of ANP rats by inhibiting TNF-α mRNA expression．

Pancreatitis,acute necrotizing; Tumor necrosis factor-alpha; Intercellular adhesion molecules; Rat; Thalidomide

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.03.018

215006 江苏苏州 苏州大学附属第一医院消化科(祝建红：现工作于常熟市第一人民医院)

陈卫昌，Email：weichangchen@126.com