人急性淋巴细胞白血病细胞容积激活性氯电流的研究*

曹国振， 左婉红， 马文波， 李 媛， 叶文才， 朱林燕， 徐 兵， 王立伟△， 陈丽新△

(暨南大学1医学院，2药学院，广东 广州 510632；3南方医科大学南方医院血液科, 广东 广州 510515)

人急性淋巴细胞白血病细胞容积激活性氯电流的研究*

曹国振1▲， 左婉红1▲， 马文波1， 李 媛1， 叶文才2， 朱林燕1， 徐 兵3， 王立伟1△， 陈丽新1△

(暨南大学1医学院，2药学院，广东 广州 510632；3南方医科大学南方医院血液科, 广东 广州 510515)

目的研究人急性淋巴细胞白血病细胞系(Molt4细胞)容积激活性氯电流。方法采用膜片钳全细胞方式记录细胞外低渗液(160 mOsmol/L)激活的Molt4细胞容积激活性氯电流，分析该电流的特性。结果Molt4细胞在等渗溶液中背景电流较小且稳定，低渗溶液诱导激活容积激活性氯电流，该电流呈现较明显的外向优势，在钳制电压0 mV～±120 mV及脉冲波宽200 ms条件下，没有观察到明显的电压依赖性失活和时间依赖性失活。该电流具有容积敏感性，可被细胞外高渗刺激所抑制。氯通道阻断剂他莫昔芬显著抑制容积激活性氯电流, 对内向电流和外向电流的抑制作用无显著差异。结论Molt4细胞膜存在容积敏感性氯通道；低渗刺激可激活该通道产生容积激活性氯电流；该通道对氯通道阻断剂他莫昔芬敏感。

氯通道； Molt4细胞系； 膜片钳术

调节性细胞容积减小(regulatory volume decrease, RVD)是指细胞在低渗刺激时, 细胞发生膨胀、容积增大激活了细胞的容积调节功能,导致胞内的溶质(主要是离子)及水份外流,使已膨胀的细胞容积向正常容积转化的过程。在这个过程中可以激活氯通道开放并产生容积激活性氯电流。我们前文报道细胞容积调节广泛参与多种细胞的生理活动，并研究了容积激活性氯电流在细胞容积调节中的作用[1-4]。目前人们对血液细胞容积激活性氯电流的作用及特点尚不十分清楚。本实验以人急性淋巴细胞白血病细胞系Molt4细胞作为研究对象，通过降低细胞外渗透压使细胞发生低渗性肿胀，观察容积激活性氯电流的变化，并分析其特性，这有助于了解淋巴细胞氯通道在细胞容积调节中的作用，并为以后深入了解氯通道在白血病细胞增殖及凋亡中的作用奠定基础。

材 料 和 方 法

1细胞培养

人急性T 淋巴细胞白血病细胞株Molt4培养于10 %新生牛血清、1×105U/L 青霉素和 100 mg/L 链霉素的RPMI- 1640(Roswell Park Memorial Institute-1640) 培养液中， 于5%CO2、饱和湿度、37 ℃恒温培养箱中培养，每2 d传代1次。取对数生长期细胞，将细胞悬液接种在包被多聚赖氨酸的玻片上，待细胞贴壁1 h后进行实验。

2主要试剂及溶液

等渗灌流液(isotonic solution，Iso)含(mmol/L):70 NaCl, 0.5 MgCl2,2 CaCl2, 10 HEPES和140 D - 甘露醇。用D - 甘露醇调节渗透压至300 mOsmol/L。低渗灌流液(47% hypotonic solution)渗透压为160 mOsmol/L，除不含D - 甘露醇外，其它成分和浓度与等渗液相同，因为该液体渗透压(160 mOsmol/L)比等渗液渗透压(300 mOsmol/L)低47%，故又称47%低渗液(47% hypotonic solution)。高渗灌流液渗透压为440 mOsmol/L, 比等渗液渗透压高47%，又称47% 高渗液(47% hypertonic solution)。除溶液中D -甘露醇为280 mmol/L 外,余同等渗液。各灌流液分别用Tris(三羟甲基氨基甲烷)液调pH 至7.4。在离子置换实验中，低渗液中的氯化钠被等量的葡萄糖酸钠或碘化钠置换。电极内液含(mmol/L):70 N -methyl - D - glucamine chloride(NMDG - Cl) , 1.2 MgCl2, 10 HEPES, 1 EGTA, 140 D - 甘露醇 和2 ATP。用Tris调至pH 7.25, 渗透压调至300 mOsmol/L。用冰点渗透压计(Osmomat030, Gonotec) 检测各溶液渗透压。RPMI-1640、小牛血清、胰蛋白酶购自Gibco。他莫昔芬(tamoxifen) 购自Sigma, 实验当天用甲醇将他莫昔芬配制成50 mmol/L原液，在临用前用灌流液稀释至所需浓度。

3单个白血病细胞容积激活性氯电流的记录

采用全细胞膜片钳方式记录细胞氯电流。用EPC - 7 膜片钳放大器(List Electronic)记录单个的Molt4细胞全细胞电流。使用外径为1.5 mm 、内径为0.86 mm的硼硅酸盐毛细玻璃管,在微电极拉制器( PB - 7)上分两步拉制微电极。微电极充灌电极内液后尖端电阻5 - 10 MΩ。电流和电压信号用CED 1401( Cambridge)数字化( 采样频率3kHz), 实验数据用EPC(CED, Cambridge) 软件分析。电压钳制模式有2 种：(1)细胞被钳制在0、-40、+40、-80、+80 mV，并不断反复循环，每个钳制脉冲波宽200 ms，间隔4 s，在每个钳制脉冲开始10 ms 后取值；(2)钳制电压-120 mV～120 mV，步增20 mV，每个钳制脉冲波宽300 ms。实验时细胞玻片安放在灌流槽中,为适应灌流环境，预先用等渗液灌流细胞5 min, 然后记录细胞在等渗灌流液中的背景电流，用细胞外灌流47%低渗液的方法，诱导并记录全细胞容积激活性氯电流的变化。当容积激活性氯电流达到最大值并稳定时，在灌流液中加入氯通道阻断剂他莫昔酚，等待氯电流达到最小值并平稳，计算电流抑制率。所有实验在室温下(20- 24 ℃)进行。

计算氯通道阻断剂对全细胞电流抑制率公式:抑制率(%) = [(Chypotonic solution-Cisotonic solution)-(Ctamoxifen-Cisotonic solution)] /(Chypotonic solution-Cisotonic solution)×100%。其中Chypotonic solution:灌流47%低渗液电流峰值； Cisotonic solution: 灌流等渗液时背景电流； Ctamoxifen:加入阻断剂他莫昔芬后的全细胞容积激活性电流值。

4统计学处理

结 果

1低渗刺激诱导的Molt4细胞氯电流

细胞被钳制在0 mV, 以0 mV、±40 mV和±80 mV顺序循环往复, 每一电位持续200 ms, 两电位之间间隔4s。在等渗条件下，背景电流较小而且相对稳定。然而，当细胞受到47%低渗刺激时，在(59.12±11.01) s氯电流开始增大( 图1A )，该电流在3-5 min内达到峰值，然后保持相对稳定，电流最大值比背景电流增大约50-60倍。

Figure 1. Chloride currents activated by the hypotonic bath solution in Molt4 cells.A:the typical time course of current recordings;B:the typical current traces at the maximal activation in hypotonic solutions. Iso: isotonic bath solution; Hypo:47% hypotonic bath solution;Hyper: 47% hypertonic bath solution. Membrane potentials were repeatedly clamped at 0,±40 and±80 mV in A and between -120 and +120 mV in 20 mV steps in B, respectively.

2Molt4细胞容积激活性氯电流的特性

在钳制电压±120 mV、钳制脉冲波宽300 ms时, 低渗刺激诱导的Molt4细胞氯电流没有出现明显的电压依赖性失活和时间依赖性的失活,见图1B。如图2所示，低渗刺激诱导的氯电流的外向电流较大[(122.66 ±19.90)pA/pF，+80 mV]，而内向电流较小[(-88.11±18.35)pA/pF，-80 mV],表现为较明显的外向优势(Plt;0.01)。该电流的翻转电位为(-2.30± 0.37) mV, 接近本实验条件氯离子平衡电位理论值(-0.9 mV)。

进一步研究发现，低渗激活的氯通道是容积敏感性的。当容积激活性氯电流达到峰值并平稳后，将细胞外的47%低渗溶液置换为47%高渗溶液, 电流迅速减小，见图1A。

3氯通道阻断剂抑制Molt4细胞容积激活性氯电流

结果显示，细胞外灌流他莫昔酚(20 μmol/L)显著抑制47%低渗液激活的Molt4全细胞氯电流,见图3A，他莫昔酚作用前后细胞氯电流有显著差异(Plt;0.01)，见图3B、3C。在钳制电压为-80 mV时，他莫昔酚对内向电流的抑制率达75.66%±6.15%(Plt;0.01)，在钳制电压为+80 mV时，抑制外向电流达78.11%±6.56%(Plt;0.01)。他莫昔酚对内向电流的抑制作用和对外向电流的抑制作用无显著差异(Pgt;0.05)，见图4。他莫昔芬对电流的抑制是可逆的，去除灌流液中的他莫昔芬，容积激活性氯电流部分恢复。

Figure 2. Current-voltage relationship of volume-activated chloride currents in Molt4 cells±s.n= 19.**Plt;0.01 vs isotonic solution. Iso: isotonic solution; Hypo: 47% hypotonic solution.

Figure 3. Inhibition of the hypotonicity-activated chloride current by the chloride channel blocker tamoxifen in Molt4 cells. Iso: isotonic solution; Hypo: 47% hypotonic solution.A:the typical time course of current recordings;B and C:the current traces at the maximal activation in hypotonic solutions and after treatment with tamoxifen,respectively. Membrane potentials were repeatedly clamped at 0,±40 and±80 mV.

Figure 4. The effects of tamoxifen on the outward(at +80 mV) and inward(at -80 mV) currents activated by the hypotonic bath solution in Molt4 cells±s.n=5.**Plt;0.01 vs control.

4容积激活性氯通道的离子选择性

当低渗激活的氯电流达到最大并平稳后，将含70 mmol/L 氯化钠的低渗灌流液换成含等量葡萄糖酸钠或碘化钠的低渗液。结果显示，低渗液中的氯化钠被葡萄糖酸钠置换后，电流减小，基线下移，见图5A,而低渗液中的氯化钠被碘化钠置换后，电流增大，基线上移(未显示结果)。分析所记录的结果表明，Molt4细胞容积激活性氯通道对碘离子和葡萄糖酸离子的相对通透性(PI/PCl、Pgluconate/PCl；设定PCl为1)分别为1.05±0.05(Plt;0.05)和0.31±0.05(Plt;0.01)，即此通道对阴离子通透性的大小为碘离子gt; 氯离子gt;葡萄糖酸离子，见图5B。

Figure 5. Anion permeability of volume- activated chloride channels in Molt4 cells±s.n=5.*Plt;0.05, **Plt;0.01 vs Cl-. Hypo: 47% hypotonic solution.

讨 论

分布在血液中的血液细胞，能直接感受血液渗透压的变化，血液渗透压的微小变化可能导致细胞发生渗透性容积变化，低渗使细胞膨胀，高渗致细胞皱缩，细胞须有较强的容积调节能力，才能维持本身正常的形态和体积。细胞在受到低渗刺激发生膨胀而激活容积调节功能,导致胞内的溶质(主要是离子)及水外流,使已膨胀的细胞容积回缩，向正常容积转化。在这个过程中，氯通道开放起重要作用，渗透性容积增大可以激活氯通道开放而产生氯电流，即容积激活性氯电流。Nilius等[5]很早在内皮细胞记录到了低渗激活的氯通道电流,发现该电流可明显减轻细胞在低渗刺激下肿胀的程度。到目前为止, 容积激活性氯通道已被证实广泛分布在多种哺乳动物的细胞膜上。容积激活性氯通道在细胞容积调节中起重要作用。

本实验通过全细胞膜片钳记录方法，探讨了人急性淋巴细胞白血病细胞系Molt4细胞在低渗刺激下容积激活性氯电流的特性。结果表明， Molt4细胞膜有容积敏感性氯通道，可被细胞外低渗刺激激活和被高渗刺激抑制。当细胞接受低渗刺激而膨胀时，细胞膜上的氯通道开放，氯离子外流，相反，当细胞处于高渗环境中而皱缩时，细胞膜氯通道关闭，氯离子外流减少。表明在低渗刺激时氯离子外流伴随水外流，而使涨大的细胞容积趋于减小。而在高渗刺激时氯离子和水外流减少而使细胞容积趋于增大。Molt4细胞膜上的容积激活性的氯电流呈现明显的外向优势，没有明显的时间依赖性失活和电压依赖性失活。Molt4细胞膜容积激活性氯通道对氯通道阻断剂他莫昔芬很敏感，他莫昔芬可以阻断已开放的氯通道，显著抑制容积激活性氯电流, 对内向电流和外向电流的抑制作用无显著差异。另外， Molt4细胞膜容积激活性氯通道对阴离子的通透性为碘离子gt;氯离子gt;葡萄糖酸离子。结果表明，Molt4细胞氯通道的特性与其它种类细胞相似，然而其容积敏感性氯电流的产生在几分钟后才能达到峰值，这提示Molt4细胞对低渗刺激的敏感性似乎低于其它种类细胞[6],其细胞膜上的氯通道需要较长时间或者较大的容积变化才能被充分激活。

细胞膜的氯通道参与细胞的多种生理活动，如细胞容积调节、细胞周期、增殖、凋亡和迁移等[7,8]，某些抗癌药物诱导的肿瘤细胞凋亡中有氯通道的参与。阻断氯通道可以降低细胞容积的调节能力，干扰细胞的功能[8]，阻断氯通道可以不同程度地逆转某些抗癌药物对细胞诱导凋亡的作用[9]。

研究容积敏感性氯通道的特点和机制不仅有助于我们很好地理解生理状况下细胞容积调节的机制，有助于更好地理解抗癌药物的作用机制，而且有助于寻找肿瘤治疗的新靶点。

[1] Chen L, Zhu L, Jacob TJ, et al. Roles of volume-activated Cl-currents and regulatory volume decrease in the J cell cycle and proliferation in nasopharyngeal carcinoma cells [J]. Cell Prolif, 2007, 40(2):253-267.

[2] Wang L, Chen L, Zhu L, et al. Regulatory volume decrease is actively modulated during the cell cycle[J]. J Cell Physiol, 2002, 193(1): 110-119.

[3] Mao J, Wang L, Fan A, et al. Blockage of volume-activated chloride channels inhibits migration of nasopharyngeal carcinoma cells [J]. Cell Physiol Biochem, 2007, 19(5-6): 249-258.

[4] 朱林燕, 左婉红, 张海峰,等. 低渗诱导高分化鼻咽癌细胞CNE-1容积激活性氯电流[J]. 中国病理生理杂志, 2009, 25( 6): 1094- 1097.

[5] Nilius B, Eggermont J, Voets T, et al. Properties of volume regulated anion channels in mammalian cells [J]. Prog Biophys Mol Biol, 1997, 68(1): 69-119.

[6] 李 辉, 王立伟, 毛建文,等. 氯通道在不同生长周期的鼻咽癌细胞迁移中的作用[J]. 中国病理生理杂志, 2005, 21( 9) : 1783- 1786.

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[8] 阳小雅, 王立伟, 朱林燕,等. 顺铂激活的低分化鼻咽癌细胞氯电流[J]. 中国病理生理杂志, 2009, 25(4) : 666 - 669.

[9] d’Anglemont de Tassigny A, Berdeaux A, Souktani R, et al. The volume-sensitive chloride channel inhibitors prevent both contractile dysfunction and apoptosis induced by doxorubicin through PI3kinase, Akt and Erk 1/2 [J]. Eur J Heart Fail, 2008, 10(1): 39-46.

Volume-activatedchloridecurrentsinhumanacutelymphoblasticleukemiaMolt4cells

CAO Guo-zhen1, ZUO Wan-hong1, MA Wen-bo1, LI Yuan1, YE Wen-cai2, ZHU Lin-yan1, XU Bing3, WANG Li-wei1, CHEN Li-xin1

(1SchoolofMedicine,2CollegeofPharmacy,JinanUniversity,Guangzhou510632,China;3DepartmentofHematology,SouthernMedicalUniversityNanfangHospital,Guangzhou510515,China.E-mail:wangliweic@sohu.com;chenlixinw@sohu.com)

AIM: To characterize the chloride current activated by extracellular hypotonic stress in human acute lymphoblastic leukemia Molt4 cells.METHODSThe technique of whole-cell patch clamp recording was used to detect the volume-activated Cl-current in Molt4 cells. The characteristics of the current were investigated.RESULTSThe background Cl-current was weak and stable under isotonic condition. However, a large Cl-current was induced by exposure of the cells to 47% hypotonic solution. The current showed a characteristic of outward rectification. No voltage-dependent inactivation and time-dependent inactivation were observed. The current was sensitive to the change of cell volume and was inhibited by extracellular hypertonic solution. Extracellular tamoxifen, which is one of the chloride channel blockers, significantly inhibited the current. The effects of tamoxifen were almost equal for both inward and outward currents (Pgt;0.05).CONCLUSIONThere are volume-activated chloride channels on the cell membrane of Molt4 cells. Exposure of the cells to a hypotonic solution activates the chloride channels and induces a volume-activated chloride current. The volume-activated Cl-channels are sensitive to tamoxifen in Molt4 cells.

Chloride channels; Molt4 cell line; Patch-clamp techniques

1000-4718(2011)04-0677-05

R733.71

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.04.11

2010-12-14

2011-02-28

国家自然科学基金资助项目(No.30771106;No.30870567; No.30871267;No.90913020;No.U0932004); 广东省自然科学基金资助项目(No. 07005974)

△通讯作者 王立伟 Tel: 020-85220260;E-mail: wangliweic@sohu.com;陈丽新 Tel: 020-85228865;E-mail: chenlixinw@sohu.com

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