体外化学模拟体系中苹果多酚抗氧化及清除亚硝酸根离子活性的研究

孙红男，孙爱东，陈 健，高雪娟

(北京林业大学生物科学与技术学院，食品科学与工程系，北京100083)

体外化学模拟体系中苹果多酚抗氧化及清除亚硝酸根离子活性的研究

孙红男，孙爱东*，陈 健，高雪娟

(北京林业大学生物科学与技术学院，食品科学与工程系，北京100083)

通过测定苹果多酚对羟自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基、亚硝酸根离子的清除作用，对脂质过氧化和β-胡萝卜素/亚油酸自氧化体系的抑制作用，以及还原能力等实验，研究了苹果多酚的体外抗氧化活性，并与VC进行了对比。实验结果表明，苹果多酚对羟自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基、亚硝酸根离子均有不同程度的清除作用，对脂质过氧化和β-胡萝卜素/亚油酸自氧化体系有一定的抑制作用，对Fe3+具有良好的还原能力。因此，苹果多酚是一种良好的天然抗氧化及清除亚硝酸根离子的活性物质。

苹果渣，苹果多酚，自由基，抗氧化活性，亚硝酸根

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

苹果多酚粉末 本实验室采用超声波辅助乙醇溶液从苹果渣中提取，NKA-9大孔树脂提纯，旋转蒸发，冷冻干燥后备用;二苯基苦味酰基苯肼基自由基(DPPH·)Sigma公司;无水乙醇、邻二氮菲、亚硝酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、盐酸、铁氰化钾、三氯乙酸、抗坏血酸、双氧水、Tris、邻苯三酚、硫酸亚铁、水杨酸等 均为分析纯。

Spectrum紫外可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司;PHS-3D型精密型pH计 上海三信仪表厂。

1.2 实验方法

1.2.1 苹果多酚对羟自由基的清除作用 采用水杨酸法［7］。在反应体系中先加入5mmol/L的水杨酸-乙醇2mL、10mmol/L的FeSO41mL，混匀，分别加入一定体积1.0mg/mL的苹果多酚溶液，使终体系中苹果多酚具有不同的浓度，并用去离子水将反应体系补至7mL，最后加 2mL H2O2启动反应，37℃保温30min，于510nm处测定吸光值。

按照式(1)计算，得到不同浓度下苹果多酚对羟自由基的清除率。

其中:A0为空白对照液的吸光值，An为加入苹果多酚后的吸光值，A'n为不加H2O2时苹果多酚的本底吸光值。

1.2.2 苹果多酚对超氧阴离子自由基的清除作用

采用邻苯三酚法［7］。取pH8.2的Tris-HCl 3mL，分别加入一定体积1.0mg/mL的苹果多酚溶液，使终体系中苹果多酚具有不同的浓度，并用去离子水使反应体系补至9mL，混匀，25℃水浴平衡20min。然后加入0.6mL 7mmol/L的邻苯三酚，混匀，立即放入分光光度计中，测定325nm处的吸光值，记录反应5min后的结果(测各样品时，以去离子水代替邻苯三酚调节0点)。

按照式(2)计算，得到不同苹果多酚浓度下对超氧阴离子自由基的清除率。

其中:A0为空白对照液的吸光值，An为加入苹果多酚后的吸光值。

1.2.3 苹果多酚对DPPH自由基的清除作用［7］取8支试管，分别加入一定体积的1.0mg/mL苹果多酚溶液，使终体系中苹果多酚具有不同的浓度，用去离子水补至3mL，每管中加入120μmol/L的DPPH乙醇溶液3mL，混匀，常温避光静置30min，517nm下测定吸光值。

按照式(3)，得到不同苹果多酚浓度下对DPPH自由基的清除率。

其中:A0为空白对照液的吸光值，An为加入苹果多酚后的吸光值。

1.2.4 苹果多酚对脂质过氧化的抑制作用［8］脂质体的制备:卵磷脂1g溶解于50mL磷酸盐缓冲溶液中(0.2mol/L pH=7.4)，充入CO2封口，置于超声波清洗机中混合均匀，4℃保存待用。

脂质过氧化活性的检测:于反应体系中先后加入1mL脂质体，0.1mL苹果多酚溶液，0.5mL 0.05mol/L的FeSO4溶液，1.2mL磷酸盐缓冲溶液(0.2mol/L pH =7.4)，混匀，37℃水浴2h。加入1%的硫代巴比妥酸溶液1mL，10%的盐酸溶液1mL，100℃水浴30min后冷却，加入5mL氯仿，3000r/min离心20min，在532nm下测吸光值。

按照式(4)，得到不同苹果多酚浓度对脂质过氧化的抑制率。

其中:A0为空白对照液的吸光值，An为加入苹果多酚后的吸光值。

1.2.5 苹果多酚还原能力的测定［9］在2.5mL pH6.6的磷酸盐缓冲液中加入不同浓度的苹果多酚溶液2.5mL，1%的铁氰化钾溶液2.5mL，混合物在50℃恒温20min后，再加入2.5mL 10%的三氯乙酸溶液，然后以3000r/min离心分离10min，取上层清液5mL加蒸馏水5mL和0.1%FeCl3溶液1mL，在700nm处测定吸光值，吸光值越高，还原能力越强。

1.2.6 苹果多酚对β-胡萝卜素/亚油酸自氧化体系的抑制作用［10］反应液的配制:将5mg的β-胡萝卜素溶于10mL氯仿中，再加入0.25mL的亚油酸和2mL的Tween-20，将此混合液移入圆底烧瓶中于50℃旋转蒸发4min，之后加入500mL蒸馏水。

向各试管中加入1mL不同浓度的苹果多酚溶液和4mL反应液，置于50℃水浴中每隔25min测其在470nm处的吸光值(分别在不同浓度苹果多酚溶液构成的体系中，以蒸馏水代替β-胡萝卜素作为空白调零)，共测量150min。

按照式(5)，得到不同苹果多酚浓度下对β-胡萝卜素/亚油酸自氧化体系的抑制率。

其中:A0和 At分别为加入苹果多酚后0和150min时的吸光值，A'0和A't分别为不加苹果多酚时0和150min时的吸光度。

其中:A0为只加入NaNO2标准溶液的吸光值，An为加入苹果多酚后的吸光值，A'n为苹果多酚溶液本底吸光值。

2 结果与分析

2.1 苹果多酚对羟自由基的清除作用

以VC作为对照，按照1.2.1的实验方法测定苹果多酚对羟自由基(·OH)的清除能力，实验结果见图1。

图1 苹果多酚对羟自由基的清除作用

由图1可知，苹果多酚和VC对羟自由基均有清除效果。苹果多酚溶液在较低浓度时就能产生清除羟自由基的效果，实验中发现当浓度低于2.5mg/mL时，清除率随浓度增加而增强;浓度高于2.5mg/mL时，清除率呈下降趋势;浓度为2.5mg/mL时，清除率最高，达到96.5%。VC清除率增幅较缓，浓度在1.3～3.0mg/mL时，苹果多酚对羟自由基的清除率高于VC。

根据文献［12］分析原因为:苹果多酚结构中含有供氢体，能够提供氢质子，使具有高度氧化性的自由基被还原，从而终止自由基的连锁反应，起到清除或抑制自由基的效果。但在高浓度时，它将反应Fe2++H2O2→Fe3++OH+·OH中的 Fe3+还原成Fe2+，反而促进了羟自由基的产生。苹果多酚及VC对羟自由基清除率的IC50分别为0.8、0.6mg/mL。

2.2 苹果多酚对超氧阴离子自由基的清除作用

以VC作为对照，按照1.2.2的实验方法测定苹果多酚对超氧阴离子自由基的清除能力，实验结果见图2。

图2 苹果多酚对超氧阴离子自由基的清除作用

由图2可知，苹果多酚和VC对超氧阴离子均有清除效果，且随浓度增大清除率提高。苹果多酚溶液浓度小于2.5mg/mL时，清除率随浓度增大而提高趋势显著;浓度大于2.5mg/mL时，清除率趋于稳定;浓度为2.5mg/mL时，清除率最高，达到98.2%。VC清除率增幅较缓，相同浓度下，苹果多酚的清除率明显高于VC。苹果多酚及VC对超氧阴离子自由基清除率的IC50分别为1.2、2.3mg/mL。

2.3 苹果多酚对DPPH自由基的清除作用

以VC作为对照，按照1.2.3的实验方法测定苹果多酚对DPPH自由基的清除能力，实验结果见图3。

由图3可知，苹果多酚和VC对DPPH自由基均有清除效果，且随浓度增大，清除率提高。苹果多酚溶液浓度小于2.0mg/mL时，清除率随浓度增大而提高;浓度大于2.0mg/mL时，清除率趋于稳定;浓度为2.0mg/mL时，清除率最高，达到95.9%。VC清除率增幅趋势与苹果多酚相近，相同浓度下，VC清除率略高于苹果多酚。苹果多酚及VC对DPPH自由基清除率的IC50分别为0.9、0.8mg/mL。

图3 苹果多酚对DPPH自由基的清除作用

2.4 苹果多酚对脂质过氧化的抑制作用

以VC作为对照，按照1.2.4的实验方法测定苹果多酚对脂质过氧化的抑制能力，实验结果见图4。

图4 苹果多酚对脂质过氧化的抑制作用

由图4可知，苹果多酚和VC对脂质过氧化均有抑制效果，且随浓度增大，抑制率提高。苹果多酚溶液浓度小于3.0mg/mL时，抑制率随浓度增大而提高;浓度大于3.0mg/mL时，抑制率趋于稳定;浓度为3.0mg/mL时，抑制率最高，达到96.8%。VC抑制率增幅缓慢，相同浓度下，苹果多酚抑制率明显高于VC。苹果多酚及VC对脂质过氧化抑制率的IC50分别为1.4、2.9mg/mL。

2.5 苹果多酚还原能力的测定

以VC作为对照，按照1.2.5的实验方法测定苹果多酚的还原能力，实验结果见图5。

图5 苹果多酚的还原能力

由图5可知，苹果多酚与VC均有良好的还原能力，是良好的电子供应者，其供应的电子除可以使Fe3+还原成Fe2+外，还可与自由基形成惰性物质，以中断自氧化链锁反应。在实验浓度范围内，苹果多酚与VC的还原能力和浓度成正相关，相同浓度下，VC的还原能力高于苹果多酚。

2.6 苹果多酚对β-胡萝卜素/亚油酸自氧化体系的抑制作用

以VC作为对照，按照1.2.6的实验方法测定苹果多酚对β-胡萝卜素/亚油酸自氧化体系的抑制能力，实验结果见图6。

图6 苹果多酚对β-胡萝卜素/亚油酸自氧化体系的抑制作用

由图6可知，苹果多酚和VC对β-胡萝卜素/亚油酸自氧化体系均有抑制效果，且随浓度增大，抑制率提高。苹果多酚溶液浓度小于3.0mg/mL时，抑制率随浓度增大而提高;浓度大于3.0mg/mL时，抑制率趋于稳定;浓度为3.0mg/mL时，抑制率最高，达到97.9%。VC抑制率增幅缓慢，相同浓度下，苹果多酚抑制率明显高于VC。苹果多酚及VC对β-胡萝卜素/亚油酸自氧化体系抑制率的 IC50分别为 1.0、2.5mg/mL。

图7 苹果多酚对亚硝酸根离子)的清除能力

以VC作为对照，按照1.2.7的实验方法测定苹果多酚对亚硝酸根离子()的清除能力，实验结果见图7。由图7可知，苹果多酚与VC对均有清除作用，并呈一定的量效关系。苹果多酚溶液浓度低于1.0mg/mL时，对的清除效果较弱，随着苹果多酚溶液浓度增大，清除效果随之提高。当浓度为1.0～2.5mg/mL时，清除率增加很快;当浓度大于2.5mg/mL，清除率增势趋缓;浓度为4.5mg/mL时，苹果多酚对NO2-的清除率最高，达到92.3%。VC清除率增幅不明显，相同浓度下，苹果多酚对亚硝酸根离子(NO2-)清除率明显高于VC。苹果多酚及VC对亚硝酸根离子(NO2-)清除率的IC50分别为1.8、2.9mg/mL。

3 讨论

生物体内氧的单电子还原，生物分子的酶促氧化和自氧化都可产生各种氧自由基，其中以羟基自由基作用最强，毒性最大。这些自由基的强反应性是导致细胞氧化损伤和衰老的主要原因［13］。本实验结果显示苹果渣多酚类物质具有良好的抗氧化性能，在对羟自由基、超氧阴离子自由基的清除作用，以及对脂质过氧化、β-胡萝卜素/亚油酸自氧化的抑制作用方面，明显优于抗坏血酸;对DPPH自由基的清除作用与抗坏血酸相似;还原能力明显低于抗坏血酸。这表明苹果渣多酚类物质与抗坏血酸具有不同的抗氧化作用机制。

亚硝胺是一种具有强烈致癌作用的化合物，它能引起人和动物的肝脏等器官恶性慢性肿瘤。正常情况下，人们直接从食物中摄入的亚硝胺量是微乎其微的，但形成N-亚硝胺类的前体物质却大量存在于食物及其体内代谢过程中［14］。亚硝酸根离子是一种能形成N-亚硝胺类的前体物质，而苹果渣多酚类物质防癌活性表现的一个重要方面就是能清除亚硝酸根离子从而抑制亚硝化反应。实验结果显示苹果渣多酚类物质具有良好的清除亚硝酸根离子能力，在浓度4.5mg/mL时，清除率可达92.3%，清除效果明显高于抗坏血酸。

4 结论

通过以上研究可知，苹果渣多酚类物质具有较强的体外抗氧化活性，对羟基自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基、亚硝酸根离子均有明显的清除作用，在实验浓度范围内，清除率随苹果多酚溶液浓度的增大而提高，清除率IC50值分别为0.8、1.2、0.9、1.8mg/mL。当苹果多酚浓度为2.5mg/mL时，对羟自由基的清除率可达 96.5%;当苹果多酚浓度为2.5mg/mL时，对超氧阴离子自由基的清除率可达98.2%;当苹果多酚浓度为2.0mg/mL时，对DPPH自由基的清除率可达 95.9%;当苹果多酚浓度为4.5mg/mL时，对亚硝酸根离子的清除率可达92.3%。苹果多酚对脂质过氧化、β-胡萝卜素/亚油酸自氧化有很强的抑制作用，实验浓度范围内，抑制率随苹果多酚溶液浓度的增大而提高，抑制率IC50值分别为1.4、1.0mg/mL。当苹果多酚浓度为3.0mg/mL时，对脂质过氧化的抑制率可达96.8%，对β-胡萝卜素/亚油酸自氧化的抑制率可达97.9%。此外，苹果多酚具有良好的还原能力。相同浓度下，苹果多酚对羟自由基、超氧阴离子自由基、亚硝酸根离子的清除作用，以及对脂质过氧化、β-胡萝卜素/亚油酸自氧化的抑制作用明显优于抗坏血酸;对DPPH自由基的清除作用与抗坏血酸相似;还原能力明显低于抗坏血酸。

本实验结论为进一步研究苹果多酚的抗氧化及抗癌活性，并为苹果多酚在抗氧化食品、药品、化妆品方面的开发以及药理学的研究提供了理论依据。

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Study on antioxidant activity and nitrite scavenging activity of apple polyphenols in vitro simulated chemical system

SUN Hong-nan，SUN Ai-dong*，CHEN Jian，GAO Xue-juan
(Department of Food Science，College of Biological Sciences and Biotechnology，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China)

The antioxidant effect of apple polyphenols from apple pomace was studied by evaluations of hydroxy radical scavenging activity，superoxide radical scavenging activity，DPPH radical scavenging activity，nitrite scavenging activity，lipid oxidation inhibiting activity，β-carotin/linolic acid oxidation inhibiting，and reducing power.Results showed that apple polyphenols had significant hydroxy radical scavenging activity，superoxide radical scavenging activity，DPPH radical scavenging activity and nitrite scavenging activity，and also significant in reducing power，lipid oxidation inhibiting activity and β-carotin/linolic acid oxidation inhibiting activity.It was indicated that apple polyphenols from apple pomace had high capacity of antioxidation and nitrite scavenging activity.

apple pomace;apple polyphenols;free radical;antioxidant activity;nitrite

TS255.1

A

1002-0306(2011)11-0079-05

苹果多酚是苹果中天然存在的一类重要生物活性物质，其中包括:类黄酮类、单宁类、酚酸类及花色苷等。本课题组近几年通过大量研究已发现，苹果多酚具有多种生物活性，如抑菌、抑制酪氨酸酶活性、抗癌等。抗氧化能力与人类健康有着密切联系，当人体抗氧化机能出现障碍时(如自由基产生、脂质过氧化、抗氧化酶活力降低等)，会出现细胞损伤，积累到一定程度就会引起心脏病、癌症、衰老等。此外，形成亚硝胺的前体物质“亚硝酸根”大量存在于食物及体内代谢过程中，亚硝胺是很强的致癌物质，阻断亚硝胺合成或消除亚硝胺的前体，是防治癌症产生的有效途径之一［1］。天然产物中的多酚类化合物，如黄酮、原花青素、有机酸等，不仅具有抗氧化作用，而且能够阻断亚硝胺合成或清除亚硝酸根［2-3］。Karamac'M［4］从荞麦种子及皮渣中分离得到的单宁酸具有很强的抗氧化活性，Kiritsakis K等人［5］研究表明，橄榄叶中提取的多酚类物质也有很好的抗氧化活性，Mariod A A等人［6］研究发现从一种蕨类植物(Monechma ciliatum)叶子中提取的多酚类物质能够提高玉米油的稳定性。本文通过几个体外化学模拟体系研究了苹果渣中多酚类物质的体外抗氧化活性以及对亚硝酸根的清除作用，以期为苹果多酚作为天然抗氧化剂和功能性食品的开发应用提供一定的理论基础和实验依据。

2010-12-08 *通讯联系人

孙红男(1983-)，女，博士研究生，主要从事苹果多酚提取及生物活性研究。

国家“十一五”支撑计划课题(2006BAD05A13)。