驴骨蛋白多肽对小白鼠抗疲劳作用的研究

缪福俊，熊 智，吴本行，董继文，孙 浩，李 彪，康 柳

(西南林业大学，西南山地森林资源保育与利用省部共建教育部重点实验室，云南昆明650224)

驴骨蛋白多肽对小白鼠抗疲劳作用的研究

缪福俊，熊 智*，吴本行，董继文，孙 浩，李 彪，康 柳

(西南林业大学，西南山地森林资源保育与利用省部共建教育部重点实验室，云南昆明650224)

研究驴骨酶解产物蛋白多肽对小鼠的抗疲劳作用，对利用废弃驴骨蛋白资源来开发其深加工产品具有重要意义。通过对小鼠灌胃不同剂量的驴骨蛋白多肽粉(专利申请号:201010198758.2)，经30d后测定小鼠体重、负重游泳力竭时间、肝糖原和血乳酸的含量，研究驴骨蛋白多肽的抗疲劳生理活性。结果表明:驴骨蛋白多肽粉对小鼠体重增长无明显影响，但是能明显延长小鼠负重游泳时间，降低血乳酸含量，增加肝糖原含量。说明驴骨蛋白多肽粉具有缓解小鼠疲劳反应、增加小鼠抗疲劳的作用，为利用驴骨资源提供科学的理论依据。

驴骨，蛋白多肽，抗疲劳

1 材料与方法

1.1 实验材料

新鲜驴腿骨 云南楚雄养驴基地提供;木瓜蛋白酶 活力15万U/g;昆明种雄性小鼠 昆明医学院实验室提供(动物生产许可证:SCXK(滇)2005-0008)，120只，体重(20±2)g。

1.2 驴骨蛋白多肽粉的制备

驴骨蛋白质含量测定方法:凯氏定氮法［11］。

驴骨多肽提取工艺:采用酶解工艺:

新鲜驴腿骨→砸碎→高压蒸煮→骨汤共同粉碎→分离脂肪→骨粉悬浮液→酶解→浓缩、干燥→驴骨多肽粉(此工艺已经申请国家发明专利，申请号:201010198758.2)。

1.3 酶解液分析

氮溶出率的测定(NSI)［12］:氮溶出率(%)=酶解液总氮量/骨粉中总氮量×100%。

三氯乙酸溶解指数(TCA-NSI)的测定［12］:TCANSI(%)=上清液中总氮量/酶解液中总氮×100%。

1.4 小鼠抗疲劳实验

1.4.1 小鼠分组 将120只昆明种系实验小白鼠随机分为4组，即空白对照组和3个受试物组，每天灌胃剂量为(低剂量组:1.2g/kg、中剂量组:3.5g/kg、高剂量组:7.0g/kg)，空白对照灌胃同体积生理盐水。灌胃期间，自由进食(合成鼠料)、饮水，连续灌喂30d后进行以下实验。

表2 驴骨蛋白多肽粉对小鼠负重游泳时间的影响

1.4.2 抗疲劳实验 根据卫生部《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)的方法［13］，测定小鼠体重、负重游泳时间﹑血乳酸和肝糖原含量。

小鼠游泳实验:末次给予受试物30min后，将尾根部负荷5%体重铅皮的小鼠置于游泳箱中游泳。箱中水深不少于30cm，水温(25±1)℃，记录小鼠自游泳开始至死亡的时间。

肝糖原测定:末次给予受试物30min后，于25℃水中不负重游泳90min处死动物，取肝脏经生理盐水漂洗后用滤纸吸干后置于冰面上的平皿内，迅速称取肝脏200mg，测定肝糖原含量(蒽酮法)。

血乳酸测定:末次给予受试物30min后，将动物置温度为25℃的水中不负重游泳20min，并于游泳后立即采眼球血20μL，测定乳酸含量。

1.5 统计方法

对实验结果进行统计处理，采用t检验来比较。

2 结果与分析

2.1 驴骨蛋白质含量的测定

经凯氏定氮仪测定，驴骨蛋白质平均含量为25.25%，比猪骨蛋白含量12.0%，牛骨蛋白含量11.5%等的含量要高出十个百分点，说明驴骨中蛋白的含量较其它动物的骨蛋白含量高，其开发利用价值巨大。

2.2 酶解液特性分析

骨蛋白的溶解度大小，无论对理论研究还是实际应用都是十分重要的。NSI是样品中能够溶于特定溶剂中的氮占总氮的百分率，TCA-NSI的高低反映了酶解产物的生化特性，以及产品中肽链的长短，一般认为TCA-NSI越大，肽链越短。小分子肽类具有良好酸溶性、低黏度、良好生理活性、在体内消化吸收快、利用率高等优点。

从表1可知，水解产物pH在3～11范围内NSI高达75%，且pH在5～9之间NSI可达到88%。说明驴骨蛋白酶解产物具有高溶解性，在相当宽的pH范围内pH的影响较小。经测定酶解产物的TCANSI为84%，说明其水解产物绝大部分为低分子肽类。这两个特点决定驴骨蛋白酶解产物可直接应用于食品中。

表1 酶解液在不同的pH下的NSI

2.3 抗疲劳实验

2.3.1 驴骨蛋白多肽粉对小鼠体重及负重游泳实验

由表2可见，各组小鼠灌胃30d后，经t检验，体重变化无显著性差异(P＞0.05)，说明驴骨蛋白多肽粉对小鼠的体重没有明显影响。各剂量组的小鼠负重游泳时间随着剂量的增多而延长，均高于对照组，中剂量组与对照组的差异达到显著水平(P＜0.05)，高剂量组与对照组的差异达到极显著水平(P＜0.01)。说明驴骨蛋白多肽粉对小鼠的运动耐力有明显的增强作用，而运动耐力的提高是抗疲劳能力加强最有力的宏观表现。

2.3.2 驴骨蛋白多肽粉对小鼠肝糖原的影响 糖原是运动能量的重要来源，糖原的储存量可以直接影响机体的运动能力，肝糖原含量直接反映机体糖原代谢情况。机体在剧烈运动时肝糖原耗竭，导致葡萄糖异生作用受抑制，血糖浓度降低，使中枢神经系统发生干扰而出现疲劳［14］。由表3可见，各剂量组的小鼠肝糖原含量随着剂量的增加而明显增多，表明驴骨蛋白多肽粉能促进小鼠机体中的糖原含量，中、高剂量组与对照组相比，经t检验，差异分别达到显著水平(P＜0.05)和极显著水平(P＜0.01)，即剂量的高低能直接影响机体中糖原的量，对机体抗疲劳有明显的促进作用。

表3 驴骨蛋白多肽粉对小鼠肝糖原含量的影响

2.3.3 驴骨蛋白多肽粉对小鼠运动后血乳酸含量的影响 乳酸的积累是运动性疲劳产生的重要因素，其乳酸含量变化对评价受试动物的抗疲劳作用非常灵敏。由于肌肉在剧烈收缩时供应的氧有限，肌细胞内糖原和葡萄糖分解的同时产生大量乳酸。乳酸的增加使肌肉中pH下降，导致疲劳［15-16］。由表4可见，小鼠的血乳酸随着剂量的增加而明显减少，中、高剂量组小鼠运动后血乳酸含量明显降低，经t检验，差异分别达到显著水平(P＜0.05)和极显著水平(P＜0.01)。表明驴骨蛋白多肽粉能降低小鼠机体的血乳酸量，在中、高剂量时其作用效果显著，能有效地缓解小鼠运动性疲劳。

表4 驴骨蛋白多肽粉对小鼠运动后血乳酪含量的影响

3 结论

驴骨蛋白经木瓜蛋白酶水解后其酶解产物在pH5～9范围内，氮溶解指数高于88%，三氯乙酸氮溶解指数达84%。该酶水解的产物具有较高的溶解性，大部分为低分子肽，可直接应用于食品中。

驴骨蛋白多肽粉受试样品可延长小鼠负重游泳时间、提高小鼠肝糖原的含量、降低运动后的血乳酸含量，且与对照组相比差异显著。依据卫生部《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)缓解体力疲劳功能的标准判断，驴骨蛋白多肽粉具有缓解体力疲劳功能。

4 讨论

目前运动性疲劳评价方法应用较多的主要有两种:耐力实验和生化检测。机体的耐力以机体连续运动至力竭的时间反映。本实验选择小鼠负重游泳实验，以小鼠力竭游泳时间作为判断小鼠耐力程度的指标;生化指标选择有两类:a.能量物质:肝糖元。b.代谢产物:血乳酸。各指标在运动时变化明显，而且变化程度与运动负荷强度一致，可作为疲劳的评价指标［17］。驴骨蛋白多肽粉能延长小鼠负重游泳时间，有利于增强机体运动;能提高小鼠肝糖原的含量，有助于提高耐力和运动能力，抵抗疲劳，糖原是运动能量的重要来源，糖原的储存量可以直接影响机体的运动能力，肝糖原含量直接反映机体糖原代谢情况;能降低运动后的血乳酸含量，可进一步增强抵抗疲劳，血乳酸作为肌肉活动的主要代谢产物，持续运动后血乳酸的数值越低，表明疲劳消除越快。

本实验的研究结果:驴骨蛋白多肽粉能够增强小鼠机体抗疲劳功能。可为驴骨蛋白后期的开发与利用提供科学的理论依据，有很好的深加工前景，有待进一步的研究。

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Study on antifatigue effects of donkey bone peptide in mice

MIAO Fu-jun，XIONG Zhi*，WU Ben-hang，DONG Ji-wen，SUN Hao，LI Biao，KANG Liu
(Southwest Forestry University，Key Laboratory for Forest Resources Conservation and Use in the Southwest Mountains of China，Ministry of Education，Kunming 650224，China)

To study the anti-fatigue function of the donkey bone peptide on mice that was significant to study of fully excavating bone protein resources and developing the deep processed products.The weight，loading swimming time，the content of blood lactic acid and liver glycogen of the experimental mice were measured after 30 days through being given different doses of the donkey bone peptide to mice.The result showed the donkey bone peptide could have no obvious impact on the weight and significantly prolong swimming time，increased the reserves of liver glycogen，and decreased the content of blood lactic acid，which indicated the peptide of donkey bone has anti-fatigue function and that would provide a theoretical basis for excavating bone protein resources.

donkey bone;peptide;anti-fatigue

TS201.4

A

1002-0306(2011)11-0411-03

我国是世界上养猪、羊、驴、禽最多的国家，驴肉产量位居世界第一，每年有大量的驴骨产生［1-2］。而且目前，云南楚雄州驴生物产业开发建设项目已经启动，未来的几年内，毛驴养殖规模将达66万头以上。驴全身都是宝，开发利用价值很大，驴皮具有很高的医药价值，是制作“国药瑰宝—阿胶”的主要原料，而驴骨与驴皮含有相同的骨胶原蛋白［3］，但这些骨骼除部分以骨粉等初级加工形式利用外，往往都被废弃，致使大量宝贵营养资源流失并导致严重的环境污染［4］。利用酶解技术将骨蛋白水解成多肽，而多肽与蛋白质和氨基酸相比具有更多优点:多肽在肠道中的吸收率高于蛋白质和氨基酸［5］;多肽具有促进脂质代谢、降低胆固醇、促进矿物质吸收、促进机体免疫等生理功能［6-8］;多肽具有较好的酸、热稳定性，水溶性，而且具有良好的抗疲劳活性［9］。国内外研究者尤其是运动学家们越来越重视天然补益性抗疲劳药物或食品的研究，为提高运动员运动耐力，延缓疲劳发生，加快疲劳恢复，目前已研制出许多抗疲劳制品［10］。但有关驴骨蛋白的抗疲劳作用研究目前尚未见报道。故本研究以新鲜驴腿骨为实验原料，采用食品级木瓜蛋白酶水解制备驴骨蛋白多肽粉，对其进行小鼠抗疲劳研究，为充分挖掘骨蛋白资源及开发骨蛋白深加工产品提供理论依据。

2010-10-15 *通讯联系人

缪福俊(1986-)，男，硕士研究生，研究方向:植物生物技术。

云南省教育厅基金项目(09J0066)。