抗生素微生物检定二剂量管碟法常用菌种培养的研究

北京市丰台区药品检验所(100071) 李婧 杜娟 陈征

中国是抗生素使用大国，也是抗生素生产大国。

1 抗生素微生物检定法的概述

抗生素是微生物在代谢中产生的具有抑制它种微生物生长活动、甚至杀灭它种微生物的化学物质。抗生素微生物检定法是测定抗生素效价的基本方法。是在适宜的条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）的方法。药典中规定的抗生素微生物检定包括两种方法，管碟法和浊度法。其中，管碟法是目前使用较多的方法。

管碟法是利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。管碟法分为二剂量法和三剂量法。二剂量法是目前使用较多的方法。对于二剂量管碟法的准确性很重要的一个影响因素就是实验菌，本文对实验菌种的培养进行讨论。

2 二剂量法管碟法操作步骤

2.1 菌种培养基本操作

2.1.1 菌种冻干粉的复状 取冻干粉一支，加营养肉汤培养基约0.5ml，将菌粉溶解后，转移至9ml肉汤培养基中，用刻度管吹洗数次后，放入培养箱中，在各菌种相应的温度下培养 20～24小时。为保证菌种的质量，营养肉汤菌液需在24小时内使用。

2.1.2 菌种传代 用接种环蘸取营养肉汤培养基一环，在营养琼脂斜面上均匀划“之”字，然后放入培养箱中，在各菌种相应的温度下培养 20小时～24小时。菌种斜面需每月传代一次，以保证菌种的良好状态。

2.1.3 科氏瓶培养 使用芽孢的菌种，需要进行长时间培养，且芽孢菌液可以保存较长时间，所以可以采用科氏瓶培养，以便得到更多高浓度的菌液。

根据菌种斜面的成长状况，选取生长状态较好的3～5支，每支斜面分别用约1ml灭菌水将菌苔洗下，并转移至同一个营养琼脂科氏瓶中，然后放入培养箱中，在各菌种相应的温度下培养7天。

在进行科氏瓶培养时，科氏瓶中培养基应向上放置，并垫高瓶口使科氏瓶稍稍倾斜，使多余的水沉至瓶底，防止水分过多影响菌种的生长。

2.1.4 菌液的制备 向培养好的斜面或科氏瓶中加入1～10ml灭菌水（或生理盐水），将菌层洗下，转移至经过灭菌处理的试管中，使用芽孢的菌种需要在70℃水浴中保温30分钟进行灭活后备用。

2.1.5 抗生素微生物检定法常用菌种的培养条件 见附表。

2.2 菌种涂片的制备方法

2.2.1 涂片 涂片的整个操作过程需在酒精灯无菌圈内进行。首先点燃酒精灯，将接种环在酒精灯外焰下充分加热灭菌，放凉，蘸取灭菌过的生理盐水一环置一张经灭菌的显微载玻片上。再将接种环用酒精灯外焰加热灭菌后，放凉，蘸取摇匀的菌液一环，涂置上述载玻片上的生理盐水上，使菌液稀释并涂抹均匀。然后将涂抹均匀的菌液时时置酒精灯火焰上加热，是菌液蛋白质凝固，待菌液干燥凝固之后涂片即制作完成。

2.2.2 染色 ①结晶紫染色。在片子上的菌膜处滴一滴结晶紫染色液，计时放置一分钟，使染色液充分染色。②冲洗。待一分钟计时结束，用纯化水冲掉染色液。冲洗时注意，将涂片倾斜，自上而下冲洗。不能直接冲菌膜，否则可能导致菌膜固定不牢被冲掉。冲掉染色液后将片子晾干再进行下一步操作。③复染。在片子的菌膜处滴加一滴革兰氏碘液，计时放置一分钟，目的在于固定蛋白质与结晶紫的结合。④冲洗。待一分钟结束后及时用纯化水冲洗掉复染液，并晾干。方法同第二步。⑤脱色。在片子的菌膜处滴加酒精一滴，环东片子，使染色剂颜色脱落。一般脱色进行30秒即可，也可根据脱色的情况而定，至洗脱染色液的颜色，但时间不宜太长。⑥冲洗。待一分钟及时结束后用纯化水冲洗掉复染液，并晾干。方法同第二步。

2.2.3 常用菌种的形态 包括枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、肺炎克雷伯菌。见附图1，2，3，4，5。

附表 抗生素微生物检定法常用菌种的培养条件

2.3 双碟的制备 取直径约90mm、高16～17mm的平底双碟，分别注入各品种抗生素标准规定项下经过灭菌处理的热培养基20ml，使其在碟底均匀摊布，将加好培养基的碟子放置在事先调整水平的实验台上，使碟内的培养基冷却凝固并保持水平。另取相应经过灭菌处理的热培养基适量，用水浴放冷至适当温度，然后加入相应的试验菌，加菌量需要经过预实验，使标准品溶液的高浓度所致的抑菌圈直径在18～22mm，摇匀后，在每一个铺好底层的碟子中加入5ml的带菌培养基，使其均匀摊布，放置在水平台上，冷却使培养基凝固，放置时间应不少于20分钟。然后在每一双碟中以等距离均匀放置4个不锈钢小管，钢管大小为内径6.0±0.1mm，高10.0±0.1mm，外径7.8±0.1mm，用陶瓦罐覆盖备用。

2.4 标准品溶液和供试品溶液的制备 按照各品种抗生素标准规定，配制标准品和供试品溶液，使其浓度为1000单位/ml，然后按照《中国药典》规定的各品种抗生素使用的缓冲液，将标准品和供试品溶液分步稀释至合适的两个浓度，高、低浓度的比例为2:1或4:1[1]。

2.5 滴加样品 配制好合适浓度的供试品和标准品溶液后，按照SH、TH、TL、SL的顺序，向制备好的双碟中加入供试品溶液和标准品溶液，每批样品的双碟数量至少为4个。最后放入培养箱中，在合适的温度下培养。

2.6 结果判定 双碟经过适宜的培养后，会产生4个抑菌圈，根据准品和供试品溶液产生抑菌圈的大小，可计算得出供试品的效价。为保证结果的准确可靠，要对参与计算的所有碟子进行统计学显著性测验和可信限的计算，在P>0.05，可信限率不大于5%的情况下，实验结果才是有效的。

3 菌种对抗生素微生物检定结果的影响

附图1 枯草芽孢杆菌

附图2 短小芽孢杆菌

在抗生素微生物检定法的结果判定中，最主要的数据是抑菌圈的大小。影响抑菌圈大小的因素有很多，如抗生素的浓度，抗生素对试验菌的敏感程度，培养时间，培养温度，菌种的生长活力，菌液浓度等。诸多因素中，菌种的影响是比较大的。菌种的形态和活性，菌龄、菌液的浓度等都会对实验结果产生影响。所以菌种培养的每一步都是实验的关键，为保证实验菌的状态良好，还应做涂片，在显微镜下观察菌种形态。

3.1 菌种形态、活力和菌龄的影响 ①菌种的形态不典型、活力不强或者菌龄过大会直接影响到抑菌圈的形态。②菌种的形态不佳，与典型菌种形态差异较大，或菌种活力不强，在培养基上生长稀疏。制成菌液后可能会造成对抗生素活力不够，长出过大的抑菌圈，也可能会造成菌对抗生素不敏感，长出过小、甚至长不出抑菌圈。③菌龄过大就会使菌液中的代数过多，由于每代菌的活力不同，新生菌活力强，老代的菌相对活力较弱，在进行抗生素微生物检定法时会长出双圈或者抑菌圈的边缘不清晰，这种情况下不能应用仪器测量。

3.2 菌液浓度的影响 菌液的浓度在《中国药典》上有具体的规定，这是因为不同种类的抗生素对敏感菌的抑菌效力是不同的。同样浓度的菌液，加入这种抗生素中能长出大小合适的圈，但是换另一种抗生素可能就不能长出大小适宜，甚至不能长出抑菌圈。所以，菌液的浓度是靠检验员在每次正式实验之前通过预试，测定几种不同浓度的菌液，通过预试结果总结出的一个最合适的浓度，因此，在此不能一概而论。

附图3 金黄色葡萄球菌

附图4 藤黄微球菌

附图5 肺炎克雷伯菌