芫花根总黄酮抗肿瘤活性的研究

黑龙江省中医药大学附属第一医院（150040）姚晶萍

黑龙江省哈尔滨市社会保险局医院（150030）倪延群

黑龙江省中医药大学附属第一医院（150040）王莹威 张洁玉 吴效科

芫花Daphne genkwa Sieb.et Zucc.为瑞香科植物。广泛分布于我国长江流域各省和黄河流域的部分地区。芫花的叶、花及根均为传统中药。芫花根在民间曾被用来治疗多种癌肿，疗效显著。芫花根还可以治疗腹水、急性乳腺炎等。化学成分研究表明，芫花根主要含有黄酮、香豆素和萜类化合物。芫花根总黄酮 (TFRD)主要由瑞香素系列的双黄酮组成，毛瑞香素是其主要成分，含量为42 .79%[1]。本研究探讨TFRD抗肿瘤活性、其对不同肿瘤及裸鼠种植瘤的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及瘤株 BALB/c（nu/nu）裸小鼠，4周龄，雌性，体重 18～20g；C57BL/6小鼠，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。饲养于屏障系统洁净层流架内（SPF级），饮用酸水（pH3～4），进食添加复合维生素B的标准饲料。饲料、垫料及其他裸鼠接触物品均经高压灭菌。室内每日保持10h光照，14h无光的明暗周期，定期紫外线照射和高压灭菌消毒。室温控制在（25±1）℃，相对湿度40%～60%。Hela、Walk-250、MCF-7、HA-116、K293-T细胞、人卵巢癌HO8910细胞株由哈医大三院肿瘤研究所惠赠。细胞置于含10%灭活胎牛血清的RPMI1640培养基中（青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml、谷氨酰胺30μg/ml），放入37℃、5% CO2孵箱，按常规方法培养，取对数生长期的细胞用于试验。

1.2 药品及试剂 胎牛血清（美国Sigma公司）；氟尿嘧啶（上海旭东海普药业有限公司，批号：031106）；二甲基亚砜（DMSO）、刀豆蛋白（ConA）、脂多糖（LPS）、MTT以及台盼蓝（均为美国 Sigma公司）；RMP I-1640与DMEM/f-12培养基（美国Sigma公司）；淋巴分离液TBD （中国医学科学院生物工程研究所）；其余试剂为国产分析纯；96孔细胞培养板以及细胞培养瓶（美国Sigma公司）。

1.3 芫花根总黄酮的制备 取芫花根2kg粉碎，以无水乙醇（固液比1∶4）60℃浸提24h，浸提液离心除渣，上清液合并浓缩得粗浸膏，粗浸膏过ADS217大孔树脂，以去离子水洗涤除去水溶性杂质，再以无水乙醇洗脱得黄色乙醇洗脱液，减压蒸馏后过200～300目硅胶柱，氯仿-甲醇（1∶1）洗脱物经浓缩即得芫花根总黄酮（TFRD）239g，得率11.95%。TFRD经吐温 280乳化，以氯化钠注射液配制成浓度确定的乳液，备用。

1.4 细胞毒活性实验 定量称取TFRD、DMSO溶解后以DMEM/f-12基本培养基稀释成6个不同浓度梯度，加入预先培养24h的Hela、Walk-250、MCF-7、HA-116、K2932 T细胞株、人卵巢癌HO8910细胞的96孔培养板中，每个浓度梯度重复5次。继续在37℃，含有5%CO2的培养箱中培养48h。MTT法测定 TFRD对肿瘤细胞以及K293-T细胞的毒性。

1.5 抗实体瘤活性实验 取BALB/c（nu/nu）裸小鼠120只，随机分为12组，每组10只，雌雄各半。人卵巢浆液性上皮癌细胞株HO8910按每鼠5×107个细胞接入小鼠的后肢腋下。TFRD乳液按30mg•kg-1、55mg•kg-1、85mg•kg-13个剂量对小鼠灌胃给药。其中3组在肿瘤接种前3d给药，3组在肿瘤接种的同时给药，3组在肿瘤接种3d后给药，1次/d，连续灌胃14d。另设正常对照组每天灌胃等体积的生理氯化钠溶液；模型组，与肿瘤接种的同时灌胃等体积的生理氯化钠溶液；阳性对照组，与肿瘤接种的同时按30mg•kg-1灌胃氟尿嘧啶。每天记录小鼠体重，并在接入肿瘤的第7天开始用游标卡尺量取肿瘤体积，每2d测量1次。根据公式：肿瘤体积=长×宽2/2计算瘤体积[2]，末次给药24h后，先眼眶取血0.5ml，制备淋巴细胞悬液，台盼蓝染色，用血球计数板统计活性细胞数。然后处死小鼠，取肿瘤称重，按公式：抑瘤率（%）=（模型组瘤重-给药组瘤重）/模型组瘤重×100%

同时取胸腺、脾脏，计算胸腺指数与脾指数。

1.6 荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖实验 无菌制备上述条件处理的小鼠脾淋巴细胞,经台盼蓝染色检测细胞活力>95%，用适量完全培养基RMPI-1640调整细胞浓度为1×106个/ml，加入96孔板，每孔100μl。将各处理组小鼠脾淋巴细胞分为3组，其中2组分别加入ConA，使其终浓度为5μg•ml-1，或加入LPS，使其终浓度为10μg•ml-1。另一组作为平行对照，不加Con A或LPS。每组设5个重复孔。在37℃、5%CO2的培养箱中培养72h，MTT法测定570nm处A值。淋巴细胞增殖能力以刺激指数（Stimulation Index，SI）表示，即SI =ACon /A或ALPS /A[2]。

1.7 荷瘤小鼠NK细胞的杀伤活性实验 同上无菌制备上述各种处理的小鼠脾淋巴细胞作为效应细胞，用完全培养基RPMI-1640调整细胞浓度为5×106ml-1，加入96孔板，每孔100μl。另取Hela细胞作靶细胞，用完全RPM I-1640培养基调整细胞浓度为1×105ml-1，加入含有小鼠脾淋巴细胞的96孔板中，每孔100μl。同时设效应细胞对照组(淋巴细胞200μl)与靶细胞对照组(Hela细胞200μl)。在37℃，5%CO2的恒温培养箱中培养8h。MTT法测定570nm处A值。根据公式[3]计算NK细胞的杀伤活性：

NK细胞杀伤率(%) = 1- (实验组A值-效应细胞对照组A值)/靶细胞对照组A值×100%

1.8 荷瘤小鼠脾淋巴细胞分泌白介素-2 （IL-2）取BALB/c（nu/nu）裸小鼠50只，雌雄各半，随机分为5组，每组10只。人卵巢癌HO8910细胞按每鼠5×107个细胞接入小鼠的后肢腋下。接种后24h开始灌胃，其中3组按30 mg•kg-1、55 mg•kg-1、85mg•kg-1个剂量对小鼠灌胃TFRD乳液。一组为模型组，灌胃等体积的生理氯化钠溶液；一组为阳性对照组，灌胃30mg•kg-1氟尿嘧啶；另设正常对照组，灌胃等体积的生理氯化钠溶液，灌胃14d。最后一次灌胃24h后处死小鼠，无菌制备脾淋巴细胞悬液加入96孔培养板中，每孔100μl，含有淋巴细胞5×106个，每孔加入终浓度为5μg•ml-1ConA溶液，置37℃、5%CO2培养箱培养24h，离心，吸取上清液即为IL-2的待测品。另取C57BL /6小鼠（20±2）g 6只，眼球放血处死，无菌制备小鼠胸腺细胞悬液加入96孔板中，每孔100μl，含胸腺细胞1×106个。将上述IL-2样品分别加入培养板中，每孔50μl，然后每孔加入终浓度为1μg•ml-1ConA溶液，另设Co2nA对照孔，参照文献[4]方法测定IL-2的活性。

1.9 统计学处理 实验数据均采用SPSS13.0软件进行t检验，统计数据采用x±s表示。

2 结果

2.1 对细胞毒活性的影响 TFRD对实验肿瘤细胞和K2932T细胞表现出不同的细胞毒活性。在设定的5个浓度中，TFRD对Hela细胞、人卵巢癌HO8910细胞显示出显著的细胞毒活性。在浓度为0.125mg•ml-1时，对这两个肿瘤细胞的抑制率分别达到65.95%和45.43%。对Walk2250、MCF27和HA-116细胞也表现出较强的细胞毒活性，在浓度为0.25mg•ml-1时对这3 个肿瘤细胞的抑制率分别为36.83%、43.19%和39.06%。与之对比，TFRD对K293-T细胞则表现出较低的细胞毒活性。在同等剂量下，抑制率仅为肿瘤细胞的1/2～1/10，见附表1。

2.2 对人卵巢癌HO8910细胞瘤生长的抑制作用 3个剂量的TFRD对人卵巢癌HO8910细胞瘤均表现出不同程度的抑制作用，并随给药时间的延长和给药剂量的增加而呈增强的趋势。3种不同时间给药对人卵巢癌HO8910细胞瘤的生长的抑制作用略有差异。接种肿瘤前3d预给药或后3d给药，3个剂量组对卵巢癌肿瘤的生长均表现出显著的抑制作用,与接种肿瘤同时给药的中剂量（50mg•kg-1）组也显示出较强的抑制作用。肿瘤接种前3d或肿瘤接种后3d给药的3个剂量组以及与肿瘤接种同时给药的中剂量(50mg•kg-1)组对人卵巢癌HO8910细胞瘤生长的抑制作用均明显地高于阳性对照组，见附表2。

附表1 TFRD对肿瘤细胞和K2932T细胞生长抑制率(±s，n =5)

附表1 TFRD对肿瘤细胞和K2932T细胞生长抑制率(±s，n =5)

注：与TFRD对K293-T细胞的抑制率比较，bP<0.05，cP<0.01

组别 抑制率（%）0.625 0.125 0.25 0.5 1（mg•ml-1）K293-T 2.43±0.23 8.90±1.04 20.68±3.06 27.92±2.65 29.03±3.61 Hela 27.38±1.53c 66.42±5.67c 71.12±5.86c 77.7±5.32c 84.05±7. 21c HO8910 16.21±1.73b 45.39±4.04c 61.13±6.08c 60.18±4.93c 79.04±8.19c Walk-250 16.20±2.61b 19.43±2.65b 37.32±3.21c 38.32±3.21c 56.10±5.21c MCF-7 6.92±1.08b 23.51±2.65b 42.29±3.80c 9.51±5.54b 53.94±4.93c HA-116 30.45±2.89c 6.35±3.79b 38.96±3.79c 43.62±4.93b 49.83±5.15c

附表2 TFRD对HO8190肿瘤细胞生长抑制作用(x±s，n =10)

附表3 对小鼠体重免疫器官及血液中淋巴细胞细胞数的影响以及对肿瘤的抑制率(x±s，n=10)

附表4 对荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖的影响(x±s，n =10)

2.3 对荷瘤小鼠体重免疫器官血液淋巴细胞数量的影响和对肿瘤的抑制作用 实验结果表明,荷瘤小鼠体重增长明显低于正常小鼠(P<0.05) 。TFRD在肿瘤接种同时给药或提前3d给药，则使荷瘤小鼠体重恢复至正常水平以上。肿瘤接种3d后给药小鼠只有低剂量组小鼠体重恢复正常水平,中高剂量组小鼠体重则低于对照组。荷瘤小鼠的脾指数、胸腺指数显著低于正常小鼠(P<0.05，P<0.01) 。TFRD 3种不同给药时间给药可使荷瘤小鼠脾指数恢复正常水平。与接种肿瘤同时给药的3个剂量组、提前3d给药的高剂量组和肿瘤接种3d后给药的中剂量组可使荷瘤小鼠胸腺指数恢复至正常水平。荷瘤小鼠淋巴细胞数量显著减少(P<0.01) 。与肿瘤接种同时给药的TFRD可使小鼠血液淋巴细胞数量恢复至正常水平,提前3d给药或接种3d后给药的小鼠血液淋巴细胞数量显著高于阳性对照组小鼠。3种不同时间给药对实验肿瘤的抑制率均在44.5%以上。其中，提前3d给药和接种后3d给药的TFRD对肿瘤的抑制作用呈现出一定的量效关系。与肿瘤接种同时给药或提前3d给药的3个剂量组，以及肿瘤接种后给药的中高剂量组对实验肿瘤的抑制作用均显著地高于阳性对照，见附表3。

2.4 对荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖的影响 实验结果显示，荷瘤小鼠脾淋巴细胞对ConA引起的增殖反应略低于正常小鼠，而对LPS引起的增殖反应则明显低于正常小鼠。TFRD预给药的荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖反应显著地高于阳性对照组小鼠，其中中剂量组可使荷瘤小鼠的脾淋巴细胞增殖反应水平超过正常小鼠。与肿瘤接种的同时给药或接种3d后给药的荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖随剂量的增加呈上升趋势。其中经中高剂量组处理的荷瘤小鼠淋巴细胞增殖水平高于正常小鼠，见附表4。

2.5 对荷瘤小鼠脾淋巴细胞分泌IL-2的影响 与正常对照组相比，荷瘤小鼠脾淋巴细胞分泌IL-2的水平有所下降(P<0.05)。与模型组相比，TFRD的3个剂量对荷瘤小鼠脾淋巴细胞产生IL-2水平有明显的促进作用，随着剂量的增加而作用逐渐增强，并且TFRD的中高剂量组显著(P<0.05)高于阳性对照氟尿嘧啶组，见附图2。

3 讨论

从TFRD组成来看，毛瑞香素B为主要成分，占总黄酮的42.79%；其次为毛瑞香素G和H。而芫花素和芫根苷等单黄酮仅占很小的比例。研究表明，毛瑞香素B是肿瘤细胞有丝分裂的抑制剂[5]。从结构上看，毛瑞香素B与G、H以及芫花醇A等双黄酮具有十分相似的分子骨架和官能团，因而这些化合物也可能具有抗肿瘤活性。实验结果表明，TFRD对人卵巢癌HO8910细胞的生长有显著的抑制作用。3种不同给药时间对小鼠肿瘤的抑制作用无显著差异。但就肿瘤体积而言，预给药组小鼠肿瘤增长的速度明显小于与接种肿瘤同时给药组小鼠。值得指出的是，TFRD在接种肿瘤7d后，给药对肿瘤的生长仍然有显著的抑制作用。体外实验表明，TFRD对Hela、HO8910、Walk-250、MFC-7和HA-116有显著的抑制作用，而对K293-T细胞生长的抑制作用相对较弱。说明TFRD对肿瘤细胞具有一定的选择性，具有潜在的抗肿瘤活性。

淋巴细胞是机体免疫系统的重要组成部分，直接参与肿瘤免疫[6]。荷瘤小鼠的淋巴细胞由于受到肿瘤细胞的诱导而逐渐凋亡[7]，同时胸腺与脾脏开始萎缩,血液淋巴细胞数量大大减少。脾脏和胸腺是淋巴细胞成熟的重要场所，这两个免疫器官的萎缩是导致淋巴细胞数量减少的重要原因。ConA主要是引起T淋巴细胞增殖，LPS主要引起B淋巴细胞增殖。TFRD能显著提高荷瘤小鼠脾脏指数和胸腺指数，这说明TFRD的抗肿瘤活性可能是通过促进荷瘤小鼠胸腺与脾脏的发育，从而增加淋巴细胞增殖来实现的[8～10]。

NK细胞是细胞免疫中的非特异性细胞，是机体免疫监视功能的重要执行者，先于T细胞发挥作用，能非特异性杀伤肿瘤细胞，其杀伤作用毋需抗原预先致敏，也不需要抗体参加，不受MHC限制，为机体抗肿瘤的第一道防线[11]。TFRD能显著提高荷瘤小鼠NK细胞的杀伤活性。

附图1 NK 细胞杀伤率比较

附图2 对荷瘤小鼠脾淋巴细胞产生IL-2水平的影响(A570，x±s，n =10)

TFRD对荷瘤小鼠脾淋巴细胞产生IL-2水平有明显的促进作用，并随着剂量的增加，作用逐渐增强。IL-2是刺激T淋巴细胞由细胞周期的G 1 期 向S 期 过 渡 的 主要调节因子，这说明TFRD是通过IL-2来间接的调控T淋巴细胞，促进T淋巴细胞增殖。

综上所述，TFRD对小鼠和人卵巢癌HO8910细胞的生长有显著的抑制作用，其抗肿瘤活性是通过选择性杀死肿瘤细胞和提高外周血淋巴细胞数量、促进淋巴细胞的增殖和提高NK细胞的杀伤活性来实现的。