芫花药材中芫花酯甲和芫花酯乙UPLC-MS含量测定方法△

李思蒙，金敏蓉，赵森淼

(1.南京中医药大学，江苏 南京 210023；2.上海中医药大学，上海 201203)

芫花药材中芫花酯甲和芫花酯乙UPLC-MS含量测定方法△

李思蒙1，2*，金敏蓉2，赵森淼2

(1.南京中医药大学，江苏 南京 210023；2.上海中医药大学，上海 201203)

目的：对芫花药材中含量较低的毒效成分芫花酯甲和芫花酯乙建立相关含量测定方法，为芫花的临床使用安全性及进一步研究提供参考。方法：采用UPLC-MS，选择离子扫描法建立相关检测方法。结果：建立了芫花药材中芫花酯甲和芫花酯乙含量测定方法，得到芫花酯甲的线性回归方程为Y=10.48X+1 234，r=0.998，芫花酯乙的线性回归方程为Y=10.92X+1 997，r=0.995。结论：所建立的芫花药材UPLC-MS含量测定方法灵敏性高，操作简便，耐用性好，测定结果可靠，能较好地测定芫花药材中微量二萜类成分。

芫花；芫花酯甲；芫花酯乙；含量测定；UPLC-MS

芫花为瑞香科植物芫花DaphnegenkwaSieb.et Zucc.的干燥花蕾[1]。《本草纲目》记载芫花有催生去胎作用[2]。近代临床主要运用该药进行引产、抗早孕以及治疗多种疑难病症，如恶性肿瘤、腹水、精神病等[3-5]。国内外关于芫花化学成分的研究报道主要包括黄酮、瑞香烷型二萜[6]、木脂素、香豆素类等化合物；生物活性方面的报道主要集中在抗肿瘤作用以及抗人类免疫缺陷病毒(HIV)等。瑞香烷型二萜类成分是目前国际研究的热点成分，也是芫花药材中的主要毒效成分，既具有较强的生物活性，同时亦容易引起致敏性反应。由于二萜类成分含量普遍很低，临床用药中又要注意避免其带来的副作用。为了完善芫花药材的质量标准，进一步开发和利用芫花药材，提高临床用药的安全性，本文采用UPLC-MS技术建立芫花中瑞香烷型二萜芫花酯甲和芫花酯乙的含量测定方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Waters ZQ 2000；METTLER 200型电子天平。

1.2 材料

11批芫花药材收集自全国各地，经上海中医药大学中药研究所吴立宏副研究员鉴定为瑞香科瑞香属植物芫花DaphnegenkwaSieb.et Zucc.的干燥花蕾，样品凭证保存于上海中药标准化研究中心。

芫花酯甲、芫花酯乙(上海中药标准化研究中心，纯度>98%)，甲醇为分析醇，乙腈为色谱纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流动相：乙腈(A)-水(B)(0.1%冰醋酸水溶液)；流速：0.4 mL·min-1；进样量：5 μL；柱温：40 ℃，洗脱程序：0～5 min，85%～50% B；5.1～8 min，20% B；8.1～10 min，5% B。

2.2 质谱条件

ESI系统条件参数设置：检测器为ZQ(正离子模式下选择芫花酯甲m/z649.6和芫花酯乙m/z587.6)；毛细管电压为3.0 kV；离子源温度为110 ℃；脱溶剂温度为300 ℃；脱溶剂气流量为650 L·h-1。对照品及样品离子色谱图见图1～3。

2.3 对照品与供试品溶液制备

2.3.1 对照品溶液制备 分别精密称取芫花酯甲和芫花酯乙对照品适量，加甲醇制成每1 mL含芫花酯甲和芫花酯乙各50 ng的溶液，即得。

2.3.2 供试品溶液制备 取芫花中粉0.25 g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，加热回流2 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 检测限与定量限

2.4.1.1 检测限 按信噪比(S/N)为3时计算，确定芫花酯甲的检测限为0.000 7 ng，芫花酯乙的检测限为0.000 8 ng。

图1 芫花酯甲和芫花酯乙对照品离子色谱图

图2 样品中芫花酯甲和芫花酯乙选择离子色谱图

图3 芫花样品离子全扫色谱图

2.4.1.2 定量限 按信噪比(S/N)为10时计算，重复测量5次求得平均值，确定芫花酯甲的定量限为0.002 3 ng，芫花酯乙的定量限为0.002 3 ng。

2.4.2 标准曲线的绘制 精密称取芫花酯甲和芫花酯乙适量，吸取甲醇配成不同浓度的对照品溶液，按2.1色谱条件进行测定，以对照品浓度(ng·mL-1)为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，得到芫花酯甲的线性回归方程为Y=10.48X+1 234，r=0.998；芫花酯乙的线性回归方程为Y=10.92X+1 997，r=0.995。

2.4.3 精密度试验 准确吸取同一对照品溶液5 μL，连续进样7次，测定芫花酯甲和芫花酯乙的峰面积，计算RSD分别为3.1%和1.8%。

2.4.4 重复性试验 取同一样品6份，精密称定，按2.3.2操作，在2.1色谱条件下进行测定，根据所得芫花酯甲和芫花酯乙的质量分数，计算RSD分别为2.4%和1.4%。

2.4.5 稳定性试验 取芫花药材中粉0.25 g，精密称定，按2.3.2操作，在2.1色谱条件下，分别在0，1，2，4，8，12，24，36，48，72 h进行测定，以峰面积进行考察，计算RSD=3.4%，结果表明样品在72 h内稳定性良好。

2.4.6 加样回收试验 取已知芫花酯甲和芫花酯乙含量的芫花药材中粉0.125 g(芫花酯甲质量分数为1.11 mg·g-1，芫花酯乙质量分数为1.37 mg·g-1)，精密称定9份，每3份加入相同量(分别为已知含量的50%，100%，150%)的芫花酯甲和芫花酯乙的对照品，按2.3.2方法操作，测定，计算回收率，结果见表1、2。

表1 芫花中芫花酯甲加样回收率测定

表2 芫花中芫花酯乙加样回收率测定

2.5 含量测定

分别取芫花中粉0.25 g，精密称定，按2.3.2操作，制成供试品溶液。精密称取芫花酯甲、芫花酯乙对照品适量，加甲醇制成每1 mL分别含芫花酯甲、芫花酯乙各50 ng的溶液，即得。分别精密吸取对照品溶液1 μL，供试品溶液5 μL，注入UPLC-MS，测定，结果见表3。

表3 芫花样品中芫花酯甲和芫花酯乙的测定(n=3) mg·g-1

3 讨论

流动相的选择分别考察了乙腈-水，乙腈-0.01%醋酸水溶液，水溶液在加入醋酸后对色谱峰的对称性有明显改善，则选用乙腈-0.01%醋酸水溶液作为流动相。

芫花酯甲和芫花酯乙是芫花抗肿瘤、抗HIV作用的主要活性成分，也是芫花致敏性的主要成分。本文选择这两个成分作为芫花UPLC-MS含量测定的指标成分，能够较好地指示出芫花中毒效成分的含量，对于临床用药的安全性以及对芫花的深入研究都有着重要意义，同时可以完善芫花药材质量优劣的认定。《中国药典》2010版以及其他相关标准都是以黄酮类物质芫花素、羟基芫花素作为芫花的指标成分进行考察，这两类黄酮类物质主要起到镇咳祛痰的作用。经文献研究芫花的传统药用物质基础主要为瑞香烷型二萜类成分，故采用芫花酯甲和芫花酯乙这两个二萜类物质中含量较高的成分为代表，能够较好地反映出芫花药材的质量优劣，从而保证芫花药材的质量。实验研究建立的芫花药材UPLC-MS含量测定方法灵敏性高，操作简便，耐用性好，测定结果可靠，能较好地测定芫花药材中的微量二萜类成分，可用于芫花药材的质量评价。

[1] 国家药典委员会，中国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2010：148.

[2] 李时珍，本草纲目 [M].第二册.北京：人民卫生出版社，1979：121.

[3] Kasai R，Lee K H，Huang H C,et al.Genkwadaphnin，a potent antileukemic diterpene fromDaphnegenkwa[J].Phytochemistry，1981，20(11)：2592-2594.

[4] Hall I H，Kasai R，Wu R Y，et al.Antitumor agents LV：Effects of genkwadaphnin and yuanhuacine on nucleic acid synthesis of P-388 lymphocytic leukemia cells，Pharm[J].Sci，1982，71(11)：1263-1267.

[5] Zhan Z J，Fan C Q，Ding J，et al.Novel diterpenoids with potent inhibitory activity against endothelium cell HMEC and cytotoxic activities form a well-known TCM plantDaphnegenkwa[J].Bioorga Med Chem，2005，13：645-655.

[6] Li S M，Chou G X，Hseu Y C,et al.Isolation of anticancer constituents from Flos Genkwa(DaphnegenkwaSieb.et Zucc.)through bioassay-guided procedures[J].Chemistry Central Journal，2013，7：159.

DeterminationofYuanhuacineandYuanhuadineinDaphnegenkwaSieb.etZucc.byUPLC-MS

LI Simeng1，2*，JINMinrong2，ZHAOSenmiao2

(1.NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing210023，China；2.ShanghaiUniversityofChineseMedicine，Shanghai，201203，China)

Objective：To establish qualitative analysis method for yuanhuacine and yuanhuadine，and to provide the reference for the clinical safety of the medicinal material ofDaphnegenkwa.Methods：The qualitative analysis method was established by UPLC-MS and ion scanning method.Results：The qualitative analysis methods was established for determining yuanhuacine and yuanhuadine.The linear regression equation of yuanhuacine wasY=10.48X+1 234，r=0.998，and the linear regression equation of yuanhuadine wasY=10.92X+1 997，r=0.995.Conclusion：The qualitative analysis forD.genkwaby UPLC-MS was high sensitive，easy and simple to handle，good durability and reliable，which was able to determine the diterpenoids for medicinal material ofD.genkwa.

Daphnegenkwa；Yuanhuacine；Yuanhuadine；Qualitative analysis；UPLC-MS

2014-10-24)

常用有毒中药质量控制方法和安全标准研究(09dZ1972800)；江苏高校优势学科建设工程资助项目

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李思蒙，讲师，研究方向：中药化学及质量标准；Tel：(025)85811514，E-mail：lisimeng0626@hotmail.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.12.008