魔芋葡甘聚糖酶解过程及各种不同分子量葡甘露低聚糖制备条件的研究

姚 雪，罗学刚，韩本超

(西南科技大学植物学系，四川绵阳621010)

魔芋葡甘聚糖酶解过程及各种不同分子量葡甘露低聚糖制备条件的研究

姚 雪，罗学刚*，韩本超

(西南科技大学植物学系，四川绵阳621010)

通过单因素实验和正交实验研究β-甘露聚糖酶在催化降解魔芋葡甘聚糖的过程中酶液浓度、缓冲液pH、温度、底物浓度以及反应时间对降解产物分子量及分子量分布的影响，同时得到各种不同分子量范围葡甘聚糖降解产物的制备条件。结果表明:在降解过程中，各因素对降解产物分子量的影响大小依次为酶液浓度＞底物浓度＞pH＞温度＞时间，对分散系数D值的影响大小依次为酶液浓度＞温度＞pH＞底物浓度＞时间。

葡甘聚糖，β-甘露聚糖酶，数均分子量，分散系数，凝胶色谱

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

魔芋精粉 四川绵阳安县都乐魔芋制品有限公司;β-甘露聚糖酶 四川禾本生物工程有限公司，酶活力≥3291u/g;氢氧化钠、磷酸二氢钾、柠檬酸、柠檬酸钠 成都科隆化工试剂有限公司，均为分析纯。

1100/1200高效液相色谱系统 美国Agilent公司;NICOLET 6700型傅立叶变换红外吸收光谱仪美国赛默飞世尔公司。

1.2 实验方法

1.2.1 β-甘露聚糖酶催化葡甘聚糖降解反应 本研究中，不同浓度酶液的制备方法为:准确称取1.0000g β-甘露聚糖酶，定容至100mL，得到酶液Ⅰ;取酶液Ⅰ10mL定容至100mL，得到酶液Ⅱ;取酶液Ⅱ中10mL定容到100mL，得到酶液Ⅲ;取酶液Ⅲ中10mL定容到100mL，得到酶液Ⅳ;取酶液Ⅳ中10mL定容到100mL，得到酶液Ⅴ;取酶液Ⅴ中10mL定容到100mL，得到酶液Ⅵ;取酶液Ⅵ中 10mL定容到100mL，得到酶液Ⅶ;以上配制好的酶液在使用时均取1mL，由于浓度相差较大，为方便标记，文中以Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ来分别代表1mL上述不同浓度的酶液。将酶液置于4℃环境保存，2d内用完。

本研究中pH为3.5、4.5和5.5的缓冲液由柠檬酸-柠檬酸钠体系组成;pH为6.5、7.5和8.5的缓冲液由磷酸氢二钾-氢氧化钠体系组成。

在β-甘露聚糖酶催化葡甘聚糖的降解反应中，主要考察不同酶液(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ)的浓度、缓冲液pH(3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5)、酶解温度(14、26、38、50、62℃)、底物浓度(0.05%、0.65%、1.25%、1.85%、2.45%、3.05%)和反应时间(2.5、5、10、20、30、40、50、60min)这五个单因素对降解产物分子量及分子量分布的影响。依据单因素实验的结果确定因素水平范围，以降解产物的数均分子量和分子量分散系数D值为考察指标，进行L18(37)正交实验，以进一步分析酶解过程中各因素对实验指标的影响程度。

酶解方法:将配制好的不同浓度的新鲜酶液1mL加入到99mL不同pH的缓冲溶液中，于不同温度下在集热式恒温加热搅拌器中保温10min;磁力搅拌作用下加入一定量已烘干至恒重的魔芋精粉，于不同的温度下准确酶解一段时间，取出，煮沸灭酶10min。

1.2.2 降解产物分子量及分子量分布测定 测试方法:采用凝胶渗透色谱法测定。仪器:美国Agilent公司的1100/1200高效液相色谱系统;色谱柱:PL aquagel-OH MIXED 8μm，300×7.5mm，货号为5064 -5282;标准品:PEO/PEG，货号为5064-5280;检测器:G1362A示差折光检测器(RID)。测试条件:流动相为娃哈哈纯净水配制的1‰的叠氮化钠溶液;流速为1mL/min;柱温为35℃;进样量为20μL;进样时间为20min。

1.2.3 降解产物红外光谱分析 将制备的降解产物用无水乙醇沉淀，4000r/min离心20min，收集白色沉淀进行真空冷冻干燥。采用NICOLET 6700型傅立叶变换红外吸收光谱仪对干燥后的产物在650～ 4000cm-1范围做傅立叶衰减全反射测定。

2 结果与讨论

2.1 酶液浓度对降解产物分子量及分散系数的影响

在反应温度50℃，缓冲液pH 7.5，反应时间为20min，底物浓度为1.25%的条件下，酶浓度对降解产物分子量的影响如图1所示。从图1中可以看出，当其它条件一致时，随着酶浓度的增加，降解产物的分子量也呈递减的趋势，在酶浓度过大时，如Ⅰ和Ⅱ，分子量的降低不明显，在酶浓度过小时，如Ⅵ和Ⅶ，分子量的降低也不明显。正交实验时选取酶浓度水平为酶液Ⅱ、Ⅳ和Ⅵ酶浓度。

图1 酶浓度对降解产物分子量及分散系数的影响

随着酶浓度的增加，分散系数呈上升趋势(A-B阶段)，达到一个最大值后又有轻微的下降趋势(B-C阶段)。魔芋葡甘聚糖的酶解主要是一个多次剪切过程［15］，即酶分子分布在部分葡甘聚糖分子链上，而其它分子链只有等酶脱附之后才能进行水解，这就造成了降解产物中始终存在着分子量几乎没有发生变化的大分子链，同时也存在已被多次剪切的小分子链，这也造成了分散系数D值较大的可能性。在A-B阶段，当酶浓度逐渐增大时，剪切的分子链和次数便随着增大，由原来全是大分子链的体系逐渐开始出现小分子链，并且随酶浓度的增加，小分子链出现的概率越大，于是D值便开始增大;在B-C阶段，酶浓度增大到一定值时，被剪切的分子链越来越多，当小分子链的数量大大超过大分子链的数量时，体系开始以小分子链为主，分散系数D值又开始有所下降。

2.2 缓冲液的pH对降解产物分子量及分散系数的影响

在反应温度50℃，酶浓度为Ⅳ，反应时间为20min，底物浓度为1.25%的条件下，缓冲液pH对降解产物分子量的影响如图2所示。从图2中可以看出，当其它条件一定，pH由3.5增加到7.5时，分子量曲线逐渐下降，在pH为7.5左右下降至最低点，此时，随着pH的增加，分子量又开始上升，即pH 7.5是酶的最适条件，此时酶活力达到最大。正交实验时选取pH的水平为3.5、5.5和7.5。

随缓冲液pH的增大，分散系数D值有所增加，在pH为3.5到5.5之间时，可能由于酶活性较低，对降解反应没有起到多大的作用，大部分分子链未得到剪切，所以分散系数较小;随着pH越来越接近酶的最适pH，酶活性增加，降解作用也更加强烈，体系中越来越多的分子链遭到了酶分子的剪切，于是分子量小的分子链开始大量出现，分散系数也随之增大。

图2 pH对降解产物分子量及分散系数的影响

2.3 温度对降解产物分子量及分散系数的影响

在酶浓度为Ⅳ，缓冲液pH为7.5，反应时间为20min，底物浓度为1.25%的条件下，温度对酶解产物分子量的影响曲线如图3所示。从图3中可以看出，温度从14℃升高至50℃时，曲线呈下降趋势，在50℃时下降至最低点，之后随温度的增加，分子量又逐步升高，即酶的最适温度为50℃。正交实验时选取温度水平为26、38、50℃。

图3 温度对降解产物分子量及分散系数的影响

在14℃，酶活性很低，于是酶对魔芋分子链的剪切作用也相当小，大部分的分子链未得到剪切，所以整个体系仍然以大分子链为主，分散系数比较小;随着温度的升高，到38℃，酶活力越来越大，剪切作用越来越强烈，体系中开始出现大量小分子链时，分散系数便开始增大;直到50℃(酶的最适温度)，小分子链占据体系总体绝大多数时，分散系数开始下降。另外一个重要原因是随着温度的升高，分子间的热运动加快，导致酶的运动速度也增加，使酶与各个魔芋分子链之间接触的机会均匀，这可能也是直到60℃，酶的活性已经开始降低，分子量又开始增加，但分散系数仍然在下降的原因。

2.4 底物浓度对降解产物分子量及分散系数的影响

在反应温度50℃，酶浓度为Ⅳ，缓冲液的pH为7.5，反应时间为20min的条件下，底物浓度对降解产物分子量的影响曲线如图4所示。从图1中可以看出，随着底物浓度的增加，降解产物的分子量逐渐上升，当底物浓度达到2.45%左右时，分子量的上升不明显，说明此时底物浓度达到了饱和。正交实验时选取底物浓度水平为0.05%、1.25%和2.45%。

图4 底物浓度对降解产物分子量及分散系数的影响

随着底物浓度的增加，D值整体呈下降趋势。当底物浓度在0.05%时，底物溶液此时处于稀溶液状态，葡甘聚糖分子链线团是处于孤立存在的，相距较远，相互之间没有交叠，加上酶的多次剪切机制，于是酶在一条分子链上的剪切作用完成后由于热运动到其它分子链上继续进行剪切，这样使得体系中分子链的分子量有大有小，且比较极端，造成D值较大。底物浓度逐渐增大，溶液体系也经历着由稀溶液→亚浓溶液→浓溶液的过程，高分子链开始发生接触，挤压在一起，进而相互交叠和穿透，增大到一定程度，分子链的充分缠绕形成了各处链段分布大致均匀的缠结网［16］，使得酶在多次剪切作用后运动到另一条底物上的距离大大缩短，甚至酶分子可以通过底物分子链在相互接触的缠结点处由一条分子链直接运动到另一条分子链上，使多次剪切的作用降低，分子量分布比较均匀，D值较小。

2.5 时间对降解产物分子量及分散系数的影响

在反应温度50℃，酶浓度为Ⅳ，缓冲液的pH为7.5，底物浓度为1.25%的条件下，酶解时间对降解产物分子量的影响曲线如图5所示。由图5可知，随着时间的延长，降解产物的分子量呈下降趋势。在前30min内，下降趋势较明显。当时间超过50min后，分子量的降低趋于平缓。从整体趋势上看，整条曲线的变化幅度不大，因此可以断定，时间对降解产物分子量的影响较小。同时也可以看出β-甘露聚糖酶的高效性，在很短的时间内便达到催化降解的目的。正交实验时选取时间水平为5、20、40min。

图5 时间对降解产物分子量及分散系数影响

从整体上看，曲线呈下降趋势，说明随着时间的延长，分散系数越来越小。当酶浓度、底物浓度、温度和pH等条件合适时，酶是相当高效的，在很短的时间内，便将分子量降低到30万以下，但是由于多次剪切的原因，分子量的大幅度降低是由部分分子链的过度剪切造成的，而此时体系中仍然存在较多的大分子链，它们甚至还没有得到剪切;之后随着时间的延长，酶脱离一个个已经被剪切的小分子链，进而转向更多的未被剪切的大分子链，使得整个体系逐渐全部向小分子链转变，于是分散系数便随着时间的延长而逐渐降低。

2.6 正交实验分析结果

在单因素实验的基础上，选择酶浓度、缓冲液pH、反应温度、底物浓度和时间五个因素，采用数均分子量(Mn)及分子量分散系数(D值)作为评价酶解体系的指标，选用L18(37)［17］正交表进行正交实验设计，对酶解反应过程做进一步评价，目的在于考察各因素对葡甘聚糖降解产物分子量及分散系数的影响程度。正交实验因素与水平见表1，实验安排及结果见表2。

表3 正交实验分析结果(完全随机模型)

表1 正交实验因素水平表

表2 正交实验结果

实验结果以DPS数据处理系统软件进行正交设计方程分析，结果见表3。

据软件分析的结果可知，在β-甘露聚糖酶催化降解KGM的过程中，各因子对降解产物数均分子量大小的影响顺序是:A＞D＞B＞C＞E，即酶液浓度＞底物浓度＞pH＞温度＞时间。其中，酶液浓度的影响在极显著水平，底物浓度的影响在显著水平，时间对降解反应的影响较小。

据软件分析的结果可知，在β-甘露聚糖酶催化降解KGM的过程中，各因子对分散系数D值的影响顺序是:A＞C＞B＞D＞E，即酶浓度＞温度＞pH＞底物浓度＞时间。此外，各因素对降解产物的分散系数D值均不显著。

2.7 降解产物红外分析结果

通过对降解产物的红外光谱分析可知，所有通过β-甘露聚糖酶降解得到的魔芋葡甘聚糖产物与未降解的魔芋葡甘聚糖具有相同的结构特征。由于样品较多，图6展示的是随机选取的几个测定结果(第4、10、18号处理)的红外光谱图。从图6中可以看出，分子量不同的葡甘聚糖的红外图谱基本相同，且与没有经过酶解的葡甘聚糖的图谱也相同。其中，3378cm-1是O-H的伸缩振动峰，这是多糖类化合物的一个特征吸收峰;2904cm-1是亚甲基的碳氢伸缩振动峰;1732cm-1是表征葡甘聚糖乙酰基存在的羰基伸缩振动峰;874cm-1处是表征β-D糖苷键构型的吸收峰;808cm-1处是吡喃环呼吸振动峰特征吸收峰。

图6 不同分子量魔芋葡甘聚糖红外光谱分析图注:1-未降解KGM;2-4号;3-10号;4-18号。

3 结论

本研究通过单因素实验研究了酶浓度、缓冲液pH、温度、底物浓度和反应时间对β-甘露聚糖酶催化降解魔芋葡甘聚糖的过程，具体分析了以上因素对降解产物的分子量及分子量分布的影响，并在单因素实验的筛选基础上，采用L18(37)正交实验分析了上述因素对降解产物分子量及分子量分布的影响程度，得到了不同分子量葡甘聚糖降解产物的制备条件。实验结果表明，在β-甘露聚糖酶催化降解魔芋葡甘聚糖的过程中，各因子对降解产物数均分子量大小的影响次序依次是:酶液浓度＞底物浓度＞pH＞温度＞时间;各因子对降解产物分散系数D值的影响次序依次是:酶液浓度＞温度＞pH＞底物浓度＞时间;并且，红外分析结果表明，各降解产物与未降解的KGM具有相同的结构特征。本研究通过对酶解过程中各因素的控制而得到不同分子量的葡甘聚糖降解产物的制备条件，使葡甘聚糖的酶解过程达到了真正意义上的可控，为各种分子量范围的魔芋葡甘露低聚糖的工业化生产以及在生产中如何通过控制酶解条件降低降解产物分子量分散系数D值提供了理论基础。

［1］刘勤晋，黄泽澄.魔芋及其保健成分KGM的功能与应用前景［J］.中国食品工业，1998，15(7):52-53.

［2］刘佩瑛.魔芋学［M］.北京:中国农业出版社，2003.

［3］李娜，罗学刚.魔芋葡甘聚糖理化性质及化学改性现状［J］.食品工业科技，2005，26(10):188-191.

［4］李春美，王元元，何玮，等.不同分子链段的魔芋葡甘露聚糖对实验性糖尿病小鼠血糖含量的影响［J］.中药材，2004，27 (2):110-112.

［5］熊德鑫，李秋剑，徐殿霞，等.低聚糖体外选择性促进双歧杆菌生长的研究［J］.食品科学，2002，23(4):181-182.

［6］香红星.β-甘露聚糖酶产生菌的诱变育种及其应用开发研究［D］.中国科学院成都生物研究所，2000.

［7］Hsiao-Ling Chen，Wayne Huey-Herng Sheu，Tsai-Sung Tai，et al.Konjac Supplement Alleviated Hypercholesterolemia and Hyperglycemia in Type 2 Diabetic Subjects-A Randomized Double-Blind Trial［J］.Journal of the American College of Nutrition，2003，22(1):36-42.

［8］杨艳燕，李小明，李顺意，等.魔芋低聚糖对小鼠血糖含量和抗氧化能力的影响［J］.中草药，2001，32(2):142-144.

［9］谢建华，庞杰，朱国辉，魔芋葡甘聚糖功能研究进展［J］.食品工业科技，2005，26(12):180-183.

［10］祁黎，李光吉，宗敏华.酶催化魔芋葡甘聚糖的可控降解［J］.高分子学报，2003(5):649-654.

［11］陶兴无，杨海娇，余勇.β-葡聚糖酶分级降解魔芋葡甘聚糖工艺研究［J］.食品工业科技，2006，27(10):139-141.

［12］李庆国，干信，邹群.魔芋葡甘低聚糖的制备和分析［J］.湖北工学院学报，2001，16(4):10-12.

［13］李剑芳.黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶及制备魔芋低聚糖研究［D］.江苏:江南大学，2007.

［14］徐春梅.β-甘露聚糖酶的生产及其酶法制备魔芋葡甘低聚糖的研究［D］.江苏:江南大学，2008.

［15］袁素霞.魔芋葡甘聚糖酶解历程动态特性研究［D］.天津:天津大学，2008.

［16］吴其晔.高分子凝聚态物理及其进展［M］.上海:华东理工大学出版社，2006:57-60.

［17］茆诗松，周纪芗，陈颖.实验设计［M］.北京:中国统计出版社，2004:411.

Study on the enzyme-catalyzed degradation of konjac glucomannan and the preparation conditions on the degradation product of various molecular weights

YAO Xue，LUO Xue-gang*，HAN Ben-chao
(Department of Botany，Southwest University of Science and Technology，Mianyang 621010，China)

To gain the preparation conditions of various molecular weight of KGM and research the influence of the enzyme concentration，pH，temperature，substrate concentration，reaction time on the degradation products molecular weight and molecular weight distribution，single factor experiment and orthogonal test were employed for investigating the degradation reaction of KGM catalyzed by β-mannanase.The results showed that effects of various factors on the molecular weight of degradation products were in the following descending order:enzyme concentration＞substrate concentration＞pH＞temperature＞time.Effects of various factors on the molecular weight distribution were in the following descending order:enzyme concentration＞temperature＞pH＞substrate concentration＞time.

konjac glucomannan;β-mannanase;number average molecular weight;dispersion coefficient; gel chromatography

TS201.2+3

A

1002-0306(2011)09-0097-05

魔芋是天南星科魔芋属多年生草本植物，其主要活性成分葡甘聚糖(KGM)是一种水溶性的天然高分子多糖，可广泛应用于环保、食品、医药、化工以及生物领域［1-2］。KGM相对分子量为200000～2000000［2］，如此巨大的分子量也使KGM具有良好的凝胶性、增稠性、成膜性等多种特性［3］，但同时巨大的分子量使KGM在水中的粘度非常大，影响了KGM在水中的溶解度，限制了KGM的应用范围。在食品领域，KGM特殊的生理功能使它深受糖尿病、肥胖症患者以及中老年消费者的喜爱，但KGM巨大的分子量却使它难消化、易阻塞，使人体产生腹胀、腹泻等一些不适症状［4］，因而被人们视为“发物”，让许多消费者对其敬而远之。与KGM使用受限形成鲜明对比的是，近年来对葡甘露低聚糖的研究和应用愈加广泛，研究发现，魔芋葡甘露低聚糖具有促生双歧杆菌［5］、吸附病原菌［6］、降脂［7］、清除自由基［8］、抑制肠内氨的生成和吸收［9］等特殊功能。能够实现KGM的可控降解，得到各种不同分子量范围的KGM产品，并且使降解后的KGM产物的分子量分散系数D值尽可能小，对魔芋资源的深度开发利用和应用范围的推广是一个关键问题。目前，在葡甘聚糖的降解方面，几乎全部是将葡甘聚糖直接降解成分子量极低的低聚糖(分子量通常在104以下)，没有得到其它范围的分子量分布的降解产物，未达到真正意义上的“可控降解”，本文的目的就是通过筛选和优化各种控制降解产物分子量和分散系数的因素，制备出不同分子量的葡甘露低聚糖。

2010-10-15 *通讯联系人

姚雪(1986-)，女，硕士研究生，研究方向:生物大分子的改性与利用。

“十一五”国家科技支撑计划项目(2007BAE42B04)。