D-阿洛酮糖的分离纯化

邢庆超，沐万孟，江 波，*，周榴明，储菲菲，张 涛

(1.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122; 2.罗盖特美国公司，基奥卡克52632，美国)

D-阿洛酮糖的分离纯化

邢庆超1，沐万孟1，江 波1，*，周榴明2，储菲菲1，张 涛1

(1.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122; 2.罗盖特美国公司，基奥卡克52632，美国)

通过生物法以D-果糖为原料生产D-阿洛酮糖，产物的分离纯化采用阴阳离子交换树脂脱色脱盐，再通过DTF-Ca2+型离子交换树脂进行分离纯化。最佳分离条件:柱温60℃，10mL进样量，1mL/min流速。通过高效液相色谱测定，分离得到的D-阿洛酮糖纯度为98.3%。

D-阿洛酮糖，分离，离子交换树脂，纯化

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

D-阿洛酮糖标样 Sigma公司;DTF-Ca2+色谱分离树脂、阳离子交换树脂001×7、阴离子交换树脂313 江苏苏青集团;其他试剂 均为分析纯。

Agilent 1200系列高效液相色谱 Agilent公司; Sugar-PakTM1糖柱 Waters公司;HL-2B型数显恒流泵、DBS-100自动部分收集器 上海沪西分析仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 D-阿洛酮糖的生物酶法转化 根据报道，D-塔格糖-3-差向异构酶(D-tagatose-3-epimerase，DTE)家族可以催化D-果糖生成D-阿洛酮糖［6-7］，本实验室构建的CS-DTE酶，是DTE酶家族中的一种，可以应用于生物法生产D-阿洛酮糖。基本反应条件为:以1L酶反应器为例，含有700g/L的D-果糖，50mmol/L的Tris-HCl，100mmol/L的NaCl，10mmol/L的Co2+，pH8.0。该溶液500mL与发酵得到的含有CS-DTE酶的湿菌体充分混合，在60℃反应10h，得到D-阿洛酮糖和D-果糖的混合物。

1.2.2 D-阿洛酮糖粗样品处理 经过酶转化得到的D-阿洛酮糖和D-果糖的混合物，分批以8000r/min离心除去菌体，再经高温煮沸使溶液中酶蛋白变性沉淀，再次以12000r/min彻底离心除去溶液中蛋白质，获得混合的糖溶液。

1.2.3 D-阿洛酮糖粗样品脱盐脱色 将再生好的阳离子交换树脂001×7和阴离子交换树脂313分别装填在两根长300mm，直径25mm的玻璃柱中。用串联方式，去离子水先通过阳离子柱，再通过阴离子柱，待平衡后将混合糖液泵入，进行脱色与脱盐，以除去糖液中的Co2+和NaCl等盐类。基本条件为:流速1.0mL/min，柱体积分别为50mL，用去离子水洗脱，收集样品。

1.2.4 离子交换色谱柱层析 脱盐脱色后的D-阿洛酮糖和D-果糖的混合物，通过一根长1m，内径2cm的带有恒温夹套的层析柱，柱内填充处理好的DTF-Ca2+色谱分离树脂，以去离子水作为流动相，分别控制不同温度50、60、70℃，不同填料柱体积200、300、400mL，不同进样量5、10、15mL，不同流速0.5、1、1.5mL/min，洗脱D-阿洛酮糖和D-果糖的混合糖液，并采用分部收集器收集洗脱样品。

1.2.5 HPLC检测D-阿洛酮糖的含量 收集后的样品通过高效液相色谱(HPLC)，与D-阿洛酮糖和D-果糖标准样品比较，定性和定量的检测各洗脱样品中的D-阿洛酮糖和D-果糖的浓度。HPLC的检测条件为:色谱柱:Sugar-PakTM1;柱温:85℃;流动相:脱气后的去离子水;流速:0.4mL/min;进样量: 10μL;检测器:示差折光检测器。

1.2.6 D-阿洛酮糖和D-果糖的分离度计算 HPLC检测后的数据，绘制分离曲线，并计算分离度，D-阿洛酮糖和D-果糖的分离度定义为［8］:

其中:trp为D-阿洛酮糖保留时间，trf为D-果糖保留时间为D-阿洛酮糖色谱峰的半峰宽度为D-果糖色谱峰的半峰宽度;以上单位均为min。

2 结果与讨论

2.1 D-阿洛酮糖的生物酶法转化率

通过DTE酶法，以D-果糖为底物，在上述条件下生成D-阿洛酮糖，并通过离心，阴阳离子柱除去蛋白、盐分等杂质，经HPLC检测(见图1)，生物酶法生产D-阿洛酮糖转化率为27.9%。

2.2 D-阿洛酮糖的离子交换树脂分离

图1 HPLC检测D-阿洛酮糖含量

2.2.1 不同温度对分离效果的影响 根据HPLC检测温度推算，确定基本条件:进样量10mL，去离子水为流动相，流速1mL/min，填料体积为200mL，分别考察柱温为50、60、70℃时，对分离效果的影响。

如图2所示，通过分离度计算公式，在柱温为50、60、70℃时，分离度依次为0.97、1.23和1.03，可见60℃分离度最大，效果较好，并以此作为下一步探讨分离效果的基本条件。

图2 温度对分离效果的影响

2.2.2 不同填料柱体积对分离效果的影响 确定基本条件:进样量10mL，去离子水为流动相，流速1mL/min，柱温60℃，分别考察填料柱体积为200、300、400mL时，对分离效果的影响。

如图3所示，当填料柱体积为200、300、400mL时，计算分离度为0.97、1.37和1.57，可见填料柱体积为400mL时，分离度最大。根据色谱理论，提高填料柱体积，可以提高理论塔板数，有效提高分离效果，但是局限于采用柱子的体积限制，填料最大体积只能达到400mL，但这为今后工业分离D-果糖和D-阿洛酮糖提供了参考。

2.2.3 不同进样量对分离效果的影响 分别采用5、 10、15mL的进样量，基本条件为:去离子水为流动相，流速1mL/min，柱温60℃，400mL填料柱体积，考察不同进样量对分离效果的影响。

图3 填料柱体积对分离效果的影响

如图4所示，当进样量分别为5、10、15mL时，计算分离度分别为1.58、1.57和0.47，可以看出5mL进样量的分离度最大，但是与10mL进样量比较，差别并不十分明显，而15mL进样量时，分离度非常小，分离效果很不理想。可以看出，当较小进样量时，柱子本身选择性压力较小，当大进样量时，柱子的负荷很大，在有效塔板数不变时，严重影响了柱效，分离效果很差。同时考虑到分离效率问题，5mL进样量和10mL进样量比较差别不大，因此，选择10mL进样量作为分离的基本条件。

2.2.4 不同流速对分离效果的影响 分别以0.5、1、1.5mL/min作为流动相的流速，在进样量10mL，去离子水为流动相，填料体积为400mL，柱温60℃时，考察不同流速对分离效果的影响。

如图5所示，当流速分别为0.5、1、1.5mL/min，计算分离度分别为1.09、1.57和1.55。从图5可以看出，在流速为1mL/min时，分离度最大、分离效果最好。

2.2.5 最佳分离条件 通过以上实验，可以确定进样量10mL，去离子水为流动相，流速1mL/min，柱温60℃，400mL填料柱体积为最佳分离条件。将分离得到的样品通过HPLC检测，如图6所示，保留时间14.1min和19.5min分别为D-果糖和D-阿洛酮糖。在上述分离条件下，可以得到纯度为98.3%的D-阿洛酮糖。

图4 不同进样量对分离曲线的影响

图5 不同流速对分离效果的影响

3 结论

3.1 D-阿洛酮糖的生物酶法制备，首次采用Ca2+型离子交换树脂对其产物分离纯化，实验证明，柱温、填料柱体积、进样量、流速均对分离效果有一定影响，其中填料柱体积直接影响理论塔板数，对分离效果影响最大，这为今后批量生产D-阿洛酮糖奠定了实验基础。

图6 最佳分离条件下HPLC检测图

3.2 最佳的分离条件为，以Ca2+型DTF离子交换树脂为填料，400mL填料体积，装填在带恒温夹套的长1m，内径2cm的层析柱内，在以去离子水作为流动相，10mL进样量，1mL/min流速，柱温60℃时，分离得到纯度为98.3%的D-阿洛酮糖。

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Separation and purification of D-psicose

XING Qing-chao1，MU Wan-meng1，JIANG Bo1，*，ZHOU Liu-ming2，CHU Fei-fei1，ZHANG Tao1
(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China; 2.Roquette America，Keokuk，IA 52632，United States)

The D-psicose was convered from D-fructose by the biological production.The technology of separation and purification of D-psicose was established according to the methods of ion exchange resin desalting and bleaching，DTF-Ca2+cation exchange chromatography.The optimal Ca2+cation exchange chromatography conditions:column temperature of 60℃，the input volume of 10mL and the flow velocity of 1mL/min.The purity of D-psicose was 98.3%.

D-psicose;separation;ion exchange resin;purification

TS241

B

1002-0306(2011)09-0236-04

甜味剂是食品添加剂和动物饲料行业中的一项重要产品，在世界范围内的应用量位居各添加剂之首，传统的甜味剂如蔗糖，一般都具有高热量、高吸收率，被认为是引起肥胖症、糖尿病、心血管疾病、龋齿等的一项重要因素［1-2］。D-阿洛酮糖是一种自然界天然存在极少的稀有糖，其食用后不易被人体代谢，几乎不产生能量，无腐蚀，而且具有良好的食品加工特性，作为一种新型的功能性甜味剂配料，在食品开发中可以替代传统甜味剂，成为功能性食品添加剂研究领域的一项热门内容［3-4］。为了进一步研究D-阿洛酮糖的性质，推动其在食品领域中的应用，获得大量、价格合理、纯度较高的D-阿洛酮糖便尤为重要。D-阿洛酮糖是D-果糖的C-3位差向异构体，都属于单糖，经研究发现，可以用D-果糖为底物，通过D-塔格糖-3-差向异构酶家族，生物酶法转化大量生产D-阿洛酮糖，但产物为D-阿洛酮糖和D-果糖的混合物，并且D-果糖含量较高，因此研究D-阿洛酮糖和D-果糖的分离技术，对今后工业化生物法生产D-阿洛酮糖具有重要的指导意义［3-4］。根据色谱相关理论，单糖之间可以利用阳离子交换树脂实现分离，原理是通过配位交换，不同的糖与阳离子形成配位络合物的形成方式、过程和其稳定程度均不同，从而使不同的糖在阳离子交换树脂上具有不同的保留行为，综合二价、三价阳离子型树脂的分离情况，二价的Ca2+和Pb2+型树脂分离效果明显优于三价的Fe3+和Al3+树脂，Pb2+型树脂的分离效果显著优于 Ca2+型树脂［5］，但是，因其毒性较大，选用Ca2+型阳离子树脂更适合食品级的分离研究，并取得了良好效果。

2010-11-30 *通讯联系人

邢庆超(1985-)，男，硕士，研究方向:食品酶技术。

中央高校基本科研业务费专项(JUSRP31002);江苏省社会发展科技支撑项目(BE2010626)。