菠萝皮渣生产虾青素的发酵条件研究

杨 瑞，翟海瑞，杨劲松

(海南大学食品学院，海南海口570228)

菠萝皮渣生产虾青素的发酵条件研究

杨 瑞，翟海瑞，杨劲松*

(海南大学食品学院，海南海口570228)

以菠萝皮渣为培养基的主要原料，采用法夫酵母(Phaffia rhodozyma)对其进行发酵生产虾青素，采用响应面分析法对法夫酵母的发酵条件进行优化研究。先用Plackett-Burman设计法实验确定重要因素，再用最陡爬坡实验法确定因素水平，最后用响应面分析方法求得的最佳发酵条件为:发酵温度为20.0℃，初始pH为5.29，糖度为6.1%，酵母膏2g/L，MgSO42g/L，(NH4)2SO44g/L，KH2PO41.5g/L，种龄36h。用此优化的发酵培养基培养法夫酵母，虾青素产量可达6.5751mg/L。

虾青素，法夫酵母，菠萝皮，响应面分析法

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

法夫酵母(Phaffia rhodozyma) 本研究室保藏并通过诱变选育获得;菠萝皮 从市场取得;菌种保藏培养基(g/L) 葡萄糖10、麦芽汁3、蛋白胨5、酵母膏3、琼脂20，pH5.0;液体种子培养基(g/L) 葡萄糖10、芽汁3、蛋白胨5、酵母膏3，pH5.0;发酵培养基(g/L) 将菠萝渣冲洗干净后用榨汁机压榨，过滤，用葡萄糖调至所需糖度，以上培养基均于121℃灭菌20min;麦芽汁、蛋白胨、酵母膏、琼脂粉 广东环凯微生物科技有限公司，生化试剂;葡萄糖、二甲基亚砜、丙酮 广州化学试剂厂，分析纯。

表2 Plackett-Burman实验设计表及实验结果

SHZ-95DF全温振荡器 金坛市大地自动化仪器厂;UV-1100紫外可见分光光度计 上海密通机电科技有限公司;80-2型离心沉淀器 上海手术器械厂;HSR025型人工气候箱 南京实验仪器厂; LS-B50L型立式压力蒸汽灭菌器 上海医用核子仪器厂;WYT手持糖量计 成都市青羊联合光学仪器成套部。

1.2 实验方法

1.2.1 种子液培养方法 取活化好的菌种接种于装有50mL种子培养基的 500mL三角瓶中，转速170r/min，温度21.5℃，培养时间48h。

1.2.2 发酵方法 在500mL的三角瓶中装入50mL培养液，接种量10%，转速170r/min，温度21.5℃，培养时间96h。

1.2.3 虾青素提取及测定［10］改进二甲基亚砜法。发酵液经离心洗涤，加入55℃预热的二甲基亚砜溶液5mL，55.0℃水浴15min，再加入4mL丙酮溶液进行提取，离心，收集上清液，以二甲基亚砜与丙酮混合液(体积比5∶4)为空白，于480nm波长下测定上清液吸光度。按下式分别计算单位体积发酵液的虾青素产量:

式中:Va为萃取液体积(mL);A480为480nm波长下的吸光度;E为比消光系数，取值2150;Vb为发酵液取样体积(mL)。

1.2.4 培养基的优化

1.2.4.1 Plackett-Burman实验设计法筛选重要因素

Plackett-Burman是一种两水平的实验设计方法，它可以用最少的实验次数达到使因素的主效应得到尽可能精确的估计，从众多考察因素中快速的筛选出最为重要的几个因素，供进一步研究用。每个因素的两水平分别取低水平与高水平，高水平约低水平的1.25倍。

本实验以虾青素的产量作为响应值，选择培养基成分和培养条件中的8个因素作为考察对象，即糖度、酵母膏、MgSO4、种龄、(NH4)2SO4、初始pH、KH2PO4、发酵温度。采用实验次数N=12的Plackett -Burman实验设计方案。

1.2.4.2 应用最陡爬坡实验法确定因素水平 由Plackett-Burman实验可知，发酵温度、初始pH、糖度这3个因素对法夫酵母的生长有重要的影响，糖度为正效应，应增加;发酵温度和初始pH为负效应，应减小。根据这3个因素效应大小的比例设定它们的变化方向及步长进行实验。

1.2.4.3 响应面分析法优化培养基 根据Plackett-Burman实验和最陡爬坡实验结果，确定对虾青素产量影响显著的3个因素:发酵温度、初始pH、糖度。并确定接近最大响应值区域的发酵温度、初始pH和糖度的取值。采用中心组合设计对这些因素进行进一步的优化。因素水平选取见表1。

表1 中心组合实验设计实验因素水平及编码表

2 结果与分析

2.1 Plackett-Burman实验设计法筛选重要因素

实验结果采用Minitab15软件进行各因素主效应分析，结果见表2和表3。

表3 Plackett-Burman实验回归分析表

由表3可知，发酵温度、糖度和初始pH是主要的影响因素，其可信度分别为99.6%、95.8%、94.6%。其中糖度为正效应，应增加;发酵温度和初始pH为负效应，应减小。其它5个因素，酵母膏、MgSO4、种龄、(NH4)2SO4、KH2PO4的重要性相对较小一些，由此确定发酵温度、初始pH和糖度为重要因素进行下一步实验。在后续的实验中将对这三个因素做进一步的优化。其余各因素的效应如下:酵母膏、MgSO4、种龄和(NH4)2SO4正效应，取高水平;KH2PO4为负效应，取低水平。因此在后续实验中，除上述三个显著因素外，其它各因素的水平调整如下:酵母膏2g/L，MgSO42g/L，(NH4)2SO44g/L，KH2PO41.5g/L，种龄36h，且在后续实验中将不再改变。

2.2 最陡爬坡实验

Plackett-Burman实验回归分析确定发酵温度、初始pH和糖度为重要因素，由此设计最速上升实验:减少发酵温度、初始pH，分别每次减少2.0℃、0.4，糖度每次增加0.5%，其它因素水平为PB实验调整后的值。考察发酵液虾青素含量的变化趋势，逼进最大响应区域。实验设计及结果见表4。

表4 最速上升实验设计及结果

由表4可知，随发酵温度、初始pH的下降和糖度的上升，虾青素产量变化趋势为先上升后下降，3号发酵瓶中的色素产量达到最大值。该处理的发酵温度、初始pH和糖度用于下面的优化实验。

2.3 响应面法优化发酵条件

由Plackett-Burman实验选出发酵温度、初始pH和糖度为重要因素，进而由最陡爬坡实验确定接近最大响应值区域的发酵温度、初始pH和糖度的取值。最后采用响应面分析法对发酵温度、初始pH和糖度进行优化。实验设计采用中心组合设计(CCD)，实验设计及结果见表5。

表5 中心组合实验设计及其实验结果

表6 回归方程中回归系数的估计值

表7 回归方程的方差分析

回归方程的 R2=0.9337，表明模型能解释93.37%虾青素素产量的变化，该模型的拟合效果较好，基本上可以用该回归方程代替实验真实点对实验结果进行分析。利用软件可得到其响应面分析图，见图1～图3。

图1 温度与pH交互作用对虾青素产量的影响

图2 温度与糖度交互作用对虾青素产量的影响

由回归方程即可计算得到三个因素的最佳组合，最终确定培养基优化后的最优组合为:发酵温度为20.0℃，初始pH为5.29，糖度为6.1%，虾青素预测产量Y=6.5925mg/L。

2.4 验证实验

为了确定建立的模型与实验结果是否相符，通过作进一步实验对模型的可靠性进行验证，以发酵温度为20.0℃、初始pH为5.29、糖度为6.1%、酵母膏 2g/L、MgSO42g/L、(NH4)2SO44g/L、KH2PO41.5g/L、种龄36h进行重复摇瓶实验，虾青素产量从4.8125mg/L提高到6.5751mg/L。预测值与实验值之间的良好拟合性证实了模型的有效性。

图3 pH与糖度交互作用对虾青素产量的影响

3 结论

研究结果表明，在法夫酵母发酵生产虾青素的过程中，发酵温度、初始pH、糖度对虾青素的提高起着重要作用，其参数分别为发酵温度为20.0℃，初始pH为5.29，糖度为6.1%。其他工艺参数分别为:酵母膏2g/L，MgSO42g/L，(NH4)2SO44g/L，KH2PO41.5g/L，种龄36h;在上述条件下发酵生产虾青素最高值可达6.5751mg/L，比未优化前的产值4.8125mg/L提高了13.7%。

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Fermentation conditions optimization of the astaxanthin production for pineapple peel by Phaffia rhodozyma

YANG Rui，ZHAI Hai-rui，YANG Jin-song*
(College of Food，Hainan University，Haikou 570228，China)

Pineapple peel as main raw material was fermented with Phaffia rhodozyma to produce astaxanthin. Response surface analysis was applied to optimize the fermentation conditions for astaxanthin production.First，used Plackett-Burman design to select the most important fermentation conditions which affecting the growth of Phaffia rhodozyma.Then，the steepest ascent was used to approach region of the fermentation conditions.The optimal fermentation conditions were determined by a central composite design and response surface analysis. And the optimal conditions follows:temperature 20.0℃，initial pH 5.29，sugar content 6.1%，yeast extract 2g/L，MgSO42g/L，(NH4)2SO44g/L，KH2PO41.5g/L，seed age 36h.Using the optimal fermentation conditions to culture Phaffia rhodozyma，the yield of astaxanthin could be up to 6.5751mg/L.

astaxanthin;Phaffia rhodozyma;pineapple peel;response surface analysis

TS201.1

B

1002-0306(2011)09-0261-04

虾青素(Astaxanthin)是一种天然类胡萝卜素，主要存在于水生动物、藻类、酵母、细菌等生物类群中。在动物体内，虾青素具有特殊的着色功能，可以使虾壳和家禽的表皮及卵黄着色，使其色泽鲜艳［1-2］，最初作为色素而被用作水产业的饵料添加剂。近几年的研究表明，虾青素具有较强的抗氧化、清除自由基、增强宿主免疫力等功能，因此在饲料、食品、化妆品及医药等领域有广阔的应用前景［3-4］。法夫酵母是一种产虾青素的酵母，它具有生长速度快、发酵周期短、能利用大多数糖、可在发酵罐中实现高密度培养等特点，是一种极具产业化前景的天然类胡萝卜素资源。但由于原始分离的法夫酵母虾青素产量水平不高，要实现工业化生产必须设法提高产量。杨劲松等对法夫酵母菌株进行复合诱变，将虾青素产量提高到7.26mg/L［5］。朱晓立等通过对法夫酵母培养基的优化使虾青素产量达到15.28mg/L［6］。另外，选用有效、价廉易得的发酵底物也是降低成本的一个重要方面，如以桉树木水解液［7］、谷物水解物［8］、甘蔗汁［9］为发酵底物已有报道。菠萝果实加工产生的副产物—果皮渣，菠萝皮渣中含有糖分、维生素、微量元素等营养物质，能够为法夫酵母生长提供一定的营养成分。本研究以菠萝皮渣的汁为主要原料，研究其最优培养基组分及发酵条件，在提高产品附加值的同时还可以保护环境。

2010-08-30 *通讯联系人

杨瑞(1984-)，女，在读硕士，研究方向:食品科学与工程、应用微生物。

国家科技计划支撑项目(2007BAD76B04)。