四种防脱载玻片使用效果的比较

吴共发张 彦薛小磊赵海燕何 楠韩慧霞＊

(1南方医科大学南方医院病理科;2南方医科大学基础医学院病理学系,广州 510515)

四种防脱载玻片使用效果的比较

吴共发1,2张 彦2薛小磊2赵海燕2何 楠2韩慧霞1,2＊

(1南方医科大学南方医院病理科;2南方医科大学基础医学院病理学系,广州 510515)

免疫组织化学; 脱片

免疫组织化学实验中,由于切片要在试剂中长时间浸泡,尤其是经过微波或高压加热抗原修复处理等操作,极易造成脱片而影响实验进程,这就要求实验前对载玻片进行防脱片处理。本研究旨在从多种硅化方法中探讨一种操作简便,防脱效果好的免疫组织化学实验防脱片处理方法。

材料和方法

1.材料

高品质普通载玻片,3-氨丙基三乙氧基硅烷(3-AMINOPROPYL TRIETHOXY-SILANE,APES)试剂,为美国 Sigma公司产品;各种浓缩型单克隆抗体、即用型二步法免疫组化广谱检测试剂盒和DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司;组织防脱载玻片,购自江苏海门神鹰实验器材厂。

2.方法

2.1 硅化玻片方法 载玻片浸入重铬酸钾硫酸清洁剂过夜,自来水冲洗干净,去离子水过3遍后烤干,进行如下硅化处理。方法Ⅰ:1:50APES无水丙酮液浸泡载玻片约60s,后用无水丙酮浸泡载玻片约60s,最后蒸馏水浸洗1min,通风处晾干装盒备用。方法Ⅱ:1:50APES无水乙醇液浸泡载玻片约60s,后用无水乙醇浸泡载玻片约60s,最后蒸馏水浸洗 1min,通风处晾干装盒备用。方法 Ⅲ:1:50APES蒸馏水溶液浸泡载玻片约60s,蒸馏水浸洗1min,通风处晾干装盒备用。

2.2 免疫组织化学方法及分组 采用SP二步法。所有组织来自南方医科大学附属南方医院病理科2005年1月至2010年5月的存档的蜡块,包括大肠正常组织、大肠癌组织及其淋巴结转移癌组织、胃癌组织及其淋巴结转移癌组织、食管癌及其淋巴结转移癌组织、子宫颈癌及其淋巴结转移癌组织。所有组织均为10%中性甲醛固定,常规石蜡包埋3μm厚切片,所有切片烤片过夜。实验分4组。分组1:所用防脱载玻片全部经方法Ⅰ硅化,共411张载玻片,检测指标为 Tiam1,CK,E-cadherin,vimentin。分组2:所用防脱载玻片全部经方法Ⅱ硅化,共137张载玻片,检测指标为Snai1。分组3:所用防脱载玻片全部经方法Ⅲ硅化,共235张载玻片,检测指标为E-cadherin,vimentin,MMP-2。分组4:所用组织防脱载玻片购自江苏海门神鹰实验器材厂,共137张,检测指标为 E-cadherin,vimentin,MMP-2。按所用一抗要求均用高压加热进行抗原修复处理,修复过程为:柠檬酸盐或EDTA修复液高压锅加热至沸腾,放入切片,喷气后持续加热3min,喷气开始时电磁炉从2000w调为1000w,室温冷却20分钟。

3.统计学方法 采用SPSS13.0统计软件进行处理,采用 Kruskal-Wallis检验比较4个分组的脱片情况,双侧 P<0.05具有统计学差异。

结 果

分组1、分组2及分组3出现不同程度部分脱片但均未出现全脱片现象;分组4出现一张脱片,脱片面积小于10%,未出现全脱片现象(表1),统计学分析显示4个分组间脱片情况无显著差异(χ2=3.883,Ρ=0.274),4种防脱玻片的防脱片效果无显著性差异,防脱效果基本相同。

表1 防脱片效果比较Table1 comparisons of effect on prerenting slices escape from glass slide

讨 论

在免疫组织化学实验中,实验的成败与是否脱片密切相关。实践证明,免疫组化组织脱落,受许多因素影响,如载玻片清洁、防脱片剂包被、蜡块选择、切片厚薄、烤片适度、抗原修复等[1]。由于本实验室研究需要,经常进行免疫组化实验,在实验过程中发觉假如载玻片防脱片效果不好会极易造成脱片而严重影响实验进程,因此载玻片必须经过涂胶或硅化处理,使组织切片牢固地贴在载玻片上。各个实验室间一般多采用不同的黏附剂,目前通用的是多聚赖氨酸(Poly-lysine)或硅化片(APES),都具有极好的防脱片效果[2]。经过本实验室人员大量应用,我们认为APES硅化玻片脱片现象非常少,防脱效果比多聚赖氨酸好[3],操作简便,经过APES处理的载玻片基本看不出痕迹。硅化玻片的APES试剂可以用丙酮、无水乙醇或蒸馏水稀释,但前两种方法玻片硅化后还需经过丙酮或无水乙醇及蒸馏水洗两个步骤,而且稍洗不干净,玻片就会出现斑点状白色沉淀,相比之下,用蒸馏水稀释APES硅化载玻片,省去丙酮或无水乙醇浸洗步骤,还节省去丙酮或无水乙醇等试剂,也不会出现白色斑点状沉淀[3]。本实验也证实了此观点。本实验用丙酮、无水乙醇及蒸馏水三种不同液体稀释APES,自己制备防脱载玻片,并将市售组织防脱载玻片作为对照,将这些载玻片应用于大量免疫组化实验。通过实践应用后比较并经统计软件分析显示,4种防脱载玻片防脱片效果无显著性差异(P>0.05),即4种防脱载玻片防脱片效果基本相同。但单从表面数据看,本实验所用市售组织防脱载玻片防脱效果似乎更佳。

综上所述,在经济条件允许情况下,购买高品质的市售组织防脱载玻片用于免疫组化实验,是一种方便快捷且效果极佳的方法。如果自己制备防脱载玻片,我们建议首选APES蒸馏水溶液硅化处理玻片即本文方法Ⅲ,此法与APES丙酮液或APES无水乙醇液硅化玻片比较,步骤更简单,更省成本且防脱效果不亚于它们,确实是一种值得推广的方法。

[1]林蓁,田甜.免疫组化染色防止脱片几点改进.实用癌症杂志,2010,25(1):73-75

[2]王小亚.免疫组织化学标准化(一).诊断病理学杂志,2008,15(1):80-81

[3]张威,骆新兰,梁英杰.制备硅化玻片技术方法的改进.中华病理学杂志,2008,31(4):362

R-331

A

10.3870/zgzzhx.2011.02.021

2010-12-10

2011-01-10

吴共发,男(1982年),汉族,硕士研究生。

＊通讯作者(To whom correspondence should be addressed)