小胶质细胞在脂多糖引起的热高敏中的作用

王爱桃武庆平徐建军姚尚龙＊崔永武邱 颐

(1华中科技大学同济医学院附属协和医院麻醉科,武汉 430030;2内蒙古医学院第二附属医院,呼和浩特 010030)

小胶质细胞在脂多糖引起的热高敏中的作用

王爱桃1,2武庆平1徐建军1姚尚龙1＊崔永武2邱 颐2

(1华中科技大学同济医学院附属协和医院麻醉科,武汉 430030;2内蒙古医学院第二附属医院,呼和浩特 010030)

目的 探讨小胶质细胞在脂多糖引起的热高敏中的作用。方法 清洁级雄性昆明小鼠,随机分成两组,每组5只,腹腔注射LPS组和注射 PBS组,在注射前及后30、60、120、240min测量小鼠足底的热痛阈;每组于注射前及后4h各处死5只取脑组织检测IL-1β、TNF-α;每组于腹腔注射4h时处死动物,免疫荧光确定脑组织中小胶质细胞的激活情况。然后分为四组,米诺环素+PBS组,米诺环素+LPS组,PBS+PBS组,PBS+LPS组,每组5只,连续三天腹腔注射米诺环素或 PBS,第三天注射LPS或PBS,在注射前及后30、60、120、240min测量小鼠足底的热痛阈;每组于注射前及后4h各处死5只取脑组织检测 IL-1β、TNF-α。结果 与注射 PBS相比 ,注射 LPS导致 IL-1β、TNF-α分泌增加 ,注射 60、120、240min小鼠的热痛阈降低;与米诺环素+PBS组、米诺环素 +LPS组、PBS+PBS组相比,PBS+LPS组导致 IL-1β、TNF-α分泌增加,注射 60、120、240min小鼠的热痛阈降低。结论 LPS激活小胶质细胞分泌促炎细胞因子导致热高敏。

小胶质细胞; 脂多糖; 热高敏; 白介素1β; 肿瘤坏死因子α

已有研究证实胶质细胞在疼痛的起始、发生与发展中具有重要作用[1,2]。其中小胶质细胞主要在疼痛的起始发挥作用,星形胶质细胞主要参与疼痛的维持[3,4]。本研究选择了小胶质细胞进行研究,希望从源头上治疗疼痛。小胶质细胞激活后可以产生促炎细胞因子 IL-1β、TNF-α,IL-1β、TNF-α参与疼痛的形成与发展[5],在炎性疼痛及慢性疼痛中扮演重要角色。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)为革兰氏阴性细菌外膜的一种成份,是强致热源。LPS作为炎症形成的刺激因素已经被广泛应用于基础研究中。本研究将LPS的致炎效应与炎性因子在疼痛中的作用相联系,阐明小胶质细胞在LPS致热高敏效应中的重要作用。

材料和方法

1.材料与仪器

LPS购自sigma公司。小胶质细胞的抑制剂米诺环素购自sigma公司。小胶质细胞的特异性标记物抗Iba-1购自Wako公司。37370型热痛测试仪(U GO BASILE公司,意大利)由华中科技大学同济医学院附属协和医院麻醉科提供。IL-1β、TNF-α ELISA试剂盒购自武汉博士德公司。

2.动物选择及分组

清洁级雄性昆明小鼠95只,体重30～40g,由华中科技大学同济医学院动物中心提供。实验前适应环境3d,室温22～24℃,周期光照,自由进食、饮水。本研究已通过动物保护协会批准。

首先将昆明小鼠随机分成两组,腹腔注射LPS 0.33mg/kg[6]组和注射等量的 PBS组,在注射前及后 30、60、120、240min 测量小鼠足底的热痛阈;每组于注射前及后4h各处死5只取脑组织匀浆检测IL-1β、TNF-α。每组于注射4h处死取脑组织做免疫荧光确定小胶质细胞激活的情况。再将昆明小鼠随机分为4组,米诺环素+PBS组,米诺环素+LPS组,PBS+PBS组,PBS+LPS组,每组 5只,连续三天腹腔注射米诺环素 50mg/kg(前两组)或等量PBS(后两组),第三天还要再注射LPS 0.33mg/kg(米诺环素+LPS组和 PBS+LPS组)或等量 PBS(米诺环素+PBS组和 PBS+PBS组),在注射前及后 30、60、120、240min 测量小鼠足底的热痛阈;每组于注射前及后4h各处死5只取脑组织匀浆检测IL-1β、TNF-α。

3.热痛阈的测定

在室温(20-25℃)、安静环境下检测,采用热痛测试仪参照文献[7]介绍的方法测定小鼠右后爪热痛阈。从光热开始照射小鼠足底到缩足反应的时间即为小鼠热伤害缩腿反应潜伏期(PWL),以此反映其热痛阈。连续测3次,每次间隔5min,取平均值。最长的热辐射时间设定为20s。单次光照射时间超过20s仍未出现缩足反应为痛觉迟钝,予以剔除。

4.ELISA 检测 IL-1β、TNF-α

脑组织80g加入磷酸盐缓冲液(p H7.4)匀浆,3000rpm/min离心20min,取上清液。根据试剂盒说明进行操作。

5.免疫荧光

腹腔注射生理盐水组和注射LPS组注射4h时,处死动物在冰上快速地取脑组织做冰冻切片,厚度为10μm,丙酮固定15min,晾干后储存于-80℃。用时取出晾干四十分钟,PBS洗5min,5%BSA室温封闭 2h,5%BSA稀释一抗(兔单克隆 antimouse Iba1),4℃孵育过夜。PBS洗10min×3次。5%BSA稀释二抗FITC-labeled anti-rabbit IgG Ab(Southern Biotechnology Associates)室温孵育90min,PBS洗5min×8次。荧光显微镜观察。

6.统计学处理

使用Excel 2003软件进行数据录入,数据管理和分析使用 SAS9.13(SAS Institute Inc. ,Cary,NC,USA)英文版。根据资料的特征分别采用了成组t检验、配对t检验、Wilcoxon秩和检验、两因素方差分析、多元线性回归分析及重复测量的方差分析等,P≤0.05被认为有统计学意义。

结 果

1.注射PBS组各个时间点热痛阈差异无统计学意义(P>0.05);注射LPS组0～120min热痛阈逐渐降低,在120min时将到最低,此后逐渐回升(P<0.01);重复测量资料的方差分析结果显示,注射LPS组小鼠的热痛阈显著低于注射PBS组,其中注射LPS 60、120、240min小鼠的热痛阈降低(P<0.01),见表 1。

表1 腹腔注射LPS不同时间热痛阈的比较 (n=5,±s)Table 1 Comparison of the change in thermal nociceptive threshold at each time point after injections(i.p.)of LPS(n=5,±s)

表1 腹腔注射LPS不同时间热痛阈的比较 (n=5,±s)Table 1 Comparison of the change in thermal nociceptive threshold at each time point after injections(i.p.)of LPS(n=5,±s)

aP<0.05,compared with the PBS group.

Group 0 min 30 min 60 min 120 min 240 min PBS 12.63 ±0.17 12.70 ±0.30 13.03 ±0.23 13.33 ±0.18 12.50 ±0.14 LPS 13.10 ±0.39 11.67 ±0.08 7.95 ±0.21a 3.29 ±0.23a 6.32 ±0.31a

2.PBS组注射前、后 IL-1 和 TNF-α含量差异无统计学意义(P>0.05);与注射前相比,LPS组注射 4h 引起 IL-1β、TNF-α分泌增加(P<0.01);与注射 PBS组相比,LPS组注射4h引起 IL-1β、TNF-α分泌增加(P<0.01),见表2。

表2 腹腔注射LPS前及后4h脑组织匀浆测量IL-1 、TNF-α含量的比较 (n=5,±s)Table 2 Comparison of the change in IL-1 and TNF-αsecretion at 0,4 h after injections(i.p.)of LPS in the brain tissues

表2 腹腔注射LPS前及后4h脑组织匀浆测量IL-1 、TNF-α含量的比较 (n=5,±s)Table 2 Comparison of the change in IL-1 and TNF-αsecretion at 0,4 h after injections(i.p.)of LPS in the brain tissues

aP<0.05,compared with‘0 h’;bP<0.05,compared with the PBS group

Index Group 0 h 4 h IL-1 PBS 20.62 ±1.28 26.83 ±3.38 LPS 20.97 ±2.77 309.73 ±10.80abTNF-α PBS 45.38 ±4.09 48.65 ±4.78 LPS 45.13 ±3.89 404.65 ±12.33ab

3.米诺环素+PBS组、米诺环素+LPS组、PBS+PBS组各个时间点热痛阈差异无统计学意义(P>0.05);PBS+LPS组0～120min热痛阈逐渐降低,在120min时将到最低,此后逐渐回升(P<0.01);与米诺环素+PBS组、米诺环素+LPS组、PBS+PBS组相比,PBS+LPS组 60、120、240min小鼠的热痛阈降低(P<0.01),见表3。

表 3 四组小鼠注射前、后 30、60、120、240min 热痛阈的比较 (n=5,±s)Table 3 Comparison of the change in thermal nociceptive threshold at each time point in the four groups(n=5,±s)

表 3 四组小鼠注射前、后 30、60、120、240min 热痛阈的比较 (n=5,±s)Table 3 Comparison of the change in thermal nociceptive threshold at each time point in the four groups(n=5,±s)

aP<0.05,compared with minocycline+PBS group;bP<0.05,compared with minocycline+LPS group;cP<0.05,compared with PBS+PBS group

Group Minocycline PBS PBS LPS PBS LPS 0 12.73 ±0.31 12.88 ±0.16 12.55 ±0.14 13.03 ±0.37 30 12.71 ±0.57 12.09 ±0.39 12.65 ±0.31 11.59 ±0.21 60 12.67 ±0.24 11.45 ±0.33 12.91 ±0.28 7.93 ±0.28abc120 12.55 ±0.17 10.99 ±0.47 13.37 ±0.31 3.33 ±0.30abc240 12.65 ±0.41 11.33 ±0.71 12.71 ±0.37 6.35 ±0.33abc

4.各组注射前 IL-1β、TNF-α含量差异无统计学意义(P>0.05);与注射前比较,米诺环素+LPS组、PBS+LPS组注射4h IL-1β、TNF-α分泌增加(P<0.01);与米诺环素+PBS组、PBS+PBS组相比,米诺环素+LPS组注射4h IL-1β、TNF-α分泌增加(P<0.01);与米诺环素+PBS组、米诺环素+LPS组、PBS+PBS组相比,PBS+LPS组注射4h IL-1β、TNF-α分泌增加(P<0.01),见表 4。

表4 四组小鼠脑组织匀浆 IL-1β、TNF-α含量的比较(n=5,±s)Table 4 Comparison of the change in IL-1 and TNF-α secretion in the brain tissues(n=5,±s)

表4 四组小鼠脑组织匀浆 IL-1β、TNF-α含量的比较(n=5,±s)Table 4 Comparison of the change in IL-1 and TNF-α secretion in the brain tissues(n=5,±s)

aP<0.05,compared with‘0 h’;bP<0.05,compared with minocycline+PBS group;cP<0.05,compared with minocycline+LPS group;dP<0.05,compared with PBS+PBS group.

Index Group Minocycline PBS PBS LPS PBS LPS IL-1β 0 h 25.8 ±3.3 23.9 ±3.1 23.5 ±3.2 20.7 ±1.3 4 h 24.2 ±2.0 72.4 ±2.7acd 24.0 ±2.1 308.9 ±13.8abcdTNF-α 0 h 45.8 ±3.3 45.6 ±3.4 45.2 ±4.3 45.4 ±3.8 4 h 44.7 ±2.6 110.7 ±13.1acd 46.4 ±3.3 405.0 ±12.7abcd

5.免疫荧光表明,腹腔注射脂多糖后引起脑部小胶质细胞的激活,表现为细胞数目的增多和细胞形态的改变。C为注射PBS组,E为注射LPS组,下面两幅图是上面方框图的放大,见图1。图例50μm。

图1 免疫荧光显示腹腔注射LPS 4h时脑组织中的小胶质细胞被激活。标尺50μmFig.1 Immunofluorescence indicated that microglia was activated at 4 h after injections(i.p. )of LPS in the brain tissues.

讨 论

疼痛困扰着大量的人群,日益成为社会的负担,由于其发病机制复杂,至今仍无有效的治疗措施。大量研究显示:胶质细胞在疼痛中扮演重要角色,如弗氏佐剂引起的关节炎[8]、骨癌[9]、坐骨神经炎症[10]、脊神经根损伤[11]和坐骨神经损伤[12],证实在不同的条件下胶质的活化导致了神经病理痛和炎性痛[13]。这些研究给疼痛的治疗带来了新的希望。小胶质细胞主要分布在中枢神经系统,占中枢神经系统中细胞总数的5%-12%,对外界刺激非常敏感,被激活时释放 IL-1β、TNF-α等炎性因子。这些炎性因子是一类小分子多肽,它们刺激伤害感受器的末端,引起疼痛敏感,并且互相促进,彼此协同,在病理性疼痛中起着举足轻重的作用,Wu CT等研究发现促炎细胞因子中 IL-1β、TNF-α可能是与疼痛加速作用最为密切的炎性因子[14]。疼痛机制的研究中发现,外周神经损伤所引发的疼痛,是由于初级传入神经元释放降钙素基因相关肽(CGRP)激活星形胶质细胞和小胶质细胞MAPK信号通路后分泌促炎细胞因子所致[15,16];还发现在完全弗氏佐剂(CAF)所致炎性痛大鼠模型中,神经生长因子(NGF)在炎性组织中表达,沿外周神经末梢逆行运输至DRG内细胞体,NGF激活胶质细胞和神经元内p38MAPK,后者可增加VR1蛋白和促炎细胞因子的表达,增加的VR1顺行转运至外周末端伤害感受器,增加对热的敏感性;增加的细胞因子促进神经细胞和胶质细胞激活,形成炎症级联反应,维持疼痛的扩大和高敏[17];且给予促炎细胞因子拮抗剂能够逆转神经病理疼痛状态[18,19]。本研究显示腹腔注射LPS可以引起昆明小鼠脑组织中 IL-1β、TNF-α的分泌,并引起热高敏。

先前的研究认为LPS很少越过血脑屏障进人中枢神经系统直接作用于神经组织,但近来的研究证实外周给予小剂量的LPS并不引起全身的炎症反应,这些LPS经血循环改变脑血管的直径和通透性,引起脑来源的神经元和小胶质细胞释放TNF-α、NO等炎症介质[21]。本研究外周给予LPS,应用Iba-1特异性标记小胶质细胞,免疫荧光检测发现脑组织中小胶质细胞被激活,同样证实外周给予LPS可以激活脑源性的小胶质细胞。

本研究首次证实LPS可以引起昆明小鼠热高敏,并且发现应用米诺环素可以降低LPS引起昆明小鼠的热高敏,米诺环素是一种二代四环素类药物,其分子量小,可以透过血脑屏障,抑制小胶质细胞的活化而对星形胶质细胞和神经元无明显作用,且本身无直接镇痛作用[20]。本研究显示腹腔注射米诺环素可以降低LPS引起昆明小鼠 IL-1β、TNF-α分泌,减低热高敏。由此我们认为小胶质细胞在LPS引起的热高敏中起关键性作用。活化的小胶质细胞增加促炎细胞因子分泌,引起痛觉高敏,其可能机制与多条信号转导通路相关。小胶质细胞表面表达大量受体,受刺激时多个信号通路被激活,其中磷酸化的p38MAPK可能通过激活其下游的转录因子进入细胞核,启动炎症因子mRNA合成,最终生成并释放大量包括 IL-1β、TNF-α等细胞因子,IL-1β、TNF-α等细胞因子一方面直接刺激伤害感受器的末端引发疼痛高敏,另一方面进一步激活神经元、胶质细胞p38MAPK通路及其他信号转导通路如ERK、JN K,释放更多的疼痛介质,从而形成疼痛级联反应的不良循环,造成痛敏。

综上所述,LPS激活小胶质细胞分泌促炎细胞因子导致热高敏。米诺环素可以减轻LPS作用于昆明小鼠引起的 IL-1β、TNF-α分泌和热高敏。

[1]Milligan ED,Sloane EM,Watkins LR.Glia in pathological pain:A role for fractalkine.Neuroimmunol,2008,198:113-120

[2]DeLeo JA. Immune and Glial Regulation of Pain. In:DeLeo JA.Sorkin LS,Watkins LR,ed. Seattle:IASP Press,2007,106-108

[3]Raghavendra V,Tanga F,Deleo JA.Inhibition of microglial activation attenuates the development but not existing hypersensitivity in a rat model of neuropathy.J Pharmacol Exp Ther,2003,306:624-630

[4]Hong Cao,Yu-Qiu Zhang.Spinal glial activation contributes to pathological pain states.Neurosci Biobehav Rev,2008,32:972-983

[5]Zhang RX,Liu B,Wang LB,et al.Spinal glial activation in a new rat model of bone cancer pain produced by prostate cancer cell inoculation of the tibia.Pain,2005,118:125-136

[6]Henry CJ,Huang Y,Wynne A,et al.Minocycline attenuates lipopolysaccharide(LPS)-induced neuroinflammation,sickness behavior,and anhedonia.J Neuroinflammation,2008,5:15

[7]Hagreaves K,Dubner R,Brown F,et a1.A new and sensitive rnethod of measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia.Pain,1988,32:77-79

[8]Lindia JA,McGowan E,Jochnowitz N,et al.Induction of CX3CL1 expression in astrocytes and CX3CR1 in microglia in the spinal cord of a rat model of neuropathic pain.J Pain,2005,6:434-438

[9]Holguin A,O’Connor KA,Biedenkapp J,et al. HIV-1 gp120 stimulates proinflammatory cytokine-mediated pain facilitation via activation of nitric oxide synthase-I(nNOS).Pain,2004,110:517-530

[10]Hains BC,Waxman SG.Activated microglia contribute to the maintenance of chronic pain after spinal cord injury.J Neurosci,2006,26:4308-4317

[11]Dongmei Wang,Yun Gao,Haiming Ji,et al.Topical and systemic administrations of ketanserin attenuate hypersensitivity and expression of CGRP in rats with spinal nerve ligation.Eur J Pharmacol,2010,627:127-130

[12]Mor D,Bembrick AL,Austion PJ,et al.Anatomically specific patterns of glial activation in the periaqueductal gray of the sub-population of rats showing pain and disability following chronic constriction injury of the sciatic nerve.J Neurosci,2010,116:1167-1184

[13]Obata K,Katsura H,Miyoshi K,et al.Toll-like receptor 3 contributes to spinal glial activation and tactile allodynia after nerve injury.J Neurochem,2008,105:2249-2259

[14]Wu CT,Jao SW,Borel CO,et al.The effect of epidural clonidine on perioperative cytokine response,postoperative pain,and bowel function in patients undergoing colorectal surgery.Anesth Analg,2004,99:502-509

[15]Parameswaran N,Disa J,Spielman WS,et al.Activation of multiple mitogen-activated protein kinases by recombinant calcitonin gene-related peptide receptor.Eur J Pharmacol,2000,389(2-3):125-130

[16]Kawamata M,Omote K.Involvement of increased excitatory amino acids and intracellular Ca2+concentration in the spinal dorsal horn in an animal model of neuropathic pain.Pain,1996,68(1):85-96

[17]Deleroix JD,Valletta JS,Wu C.NGF signaling in sensory neurons:evidence that early endosomes carry NGF retrograde signals.Neuron,2003,39:69-84

[18]Milligan ED,Twining C,Chacur M,et al.Spinal glia and proinflammatory cytokines mediate mirror-image neuropathic pain in rats.J Neurosci,2003,23:1026-1040

[19]Milligan ED,Zapata V,Schoeniger D,et al.An initial investigation of spinal mechanisms underlying pain enhancement induced by fractalkine,a neuronally released chemokine.Eur J Neurosci,2005,22:2775-2782

[20]Raghavera V,Tanga F,Deleo JA.Inhibition of microglial activation attenuates the development but not exesting hypersensitivity in a rat model of neuropathy.Pharmacol Exp Ther,2003,306(2):624-630

[21]Ruiz-Valdepenas L,Martinez-Orgado JA,Benito C,et al.Cannabidiol reduces lipopolysaccharide-induced vascular changes and inflammation in the mouse brain:an intravitalmicroscopy study.J neuroinflammation,2011,8:5

Role of Microglia in Lipopolysaccharide-induced Thermal Hyperalgesia

Wang Aitao1,2,Wu Qingping1,Xu Jianjun1,Yao Shanglong1,＊,Cui Yongwu2,Qiu Yi2

(1Department of A nesthesiology,Union Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,W uhan430030;2Department of A nesthesiology,The Second A f f iliated Hospital of Inner Monglia Medical College,Huhhot010030,China)

Objective To explore the role of microglia in the lipopolysaccharide(LPS)-induced thermal hyperalgesia.Methods After adult kunming mice

an intraperitoneal injection of PBS or LPS,thermal nociceptive thresholds,IL-1βand TNF-α were determined;activation of microglia in the brain was determined by immunofluorescence.Then,according to the different agents,injected mice were divided into 4 groups:minocycline+PBS,minocycline+LPS,PBS+PBS,and PBS+LPS.The mice received an intraperitoneal injection of PBS or minocycline(the former agent of each group)for 3 consecutive days.On the 3 day,PBS or LPS(the latter agent of each group was added).The thermal nociceptive thresholds and the expressions of brain IL-1β and TNF-α were assayed. Results LPS injection led to proinflammatory cytokine secretion and thermal hyperalgesia in kunming mice.Minocycline blocked LPS-stimulated inflammatory cytokine secretion and thermal hyperalgesia in kunming mice.Conclusion These data indicate that IL-1β and TNF-α are induced by LPS through activating brain-derived microglia,hence modulate thermal hyperalgesia.

Microglia; Lipopolysaccharide; Hyperalgesia; IL-1β; TNF-α

R329

A

10.3870/zgzzhx.2011.02.017

2010-08-10

2011-02-15

王爱桃,女(1977年),汉族,主治医师。

＊通讯作者(To whom correspondence should be addressed)