RhoC和 Ki67在非小细胞肺癌中的表达及意义

方长清 唐 娜 杨青松李 淼王业林李建华

(中国医科大学附属第一医院病理科及中国医科大学病理教研室,沈阳 110001;1抚顺市第四医院放射科,抚顺 113123;2辽宁中医药大学附属第二医院病理科,沈阳 110034)

RhoC和 Ki67在非小细胞肺癌中的表达及意义

方长清 唐 娜 杨青松1李 淼2王业林李建华＊

(中国医科大学附属第一医院病理科及中国医科大学病理教研室,沈阳 110001;1抚顺市第四医院放射科,抚顺 113123;2辽宁中医药大学附属第二医院病理科,沈阳 110034)

目的 探讨RhoC、Ki67在非小细胞肺癌中的表达状况及其与临床病理学参数间的关系。方法 利用免疫组织化学(ElivisionTMplus法),检测肺癌组织芯片中151例非小细胞肺癌患者RhoC、Ki67的表达情况。结果 肺癌组织的RhoC蛋白阳性表达率为59.60%(90/151),相应癌旁组织 RhoC阳性表达率为32.7%(16/49),差别有显著意义(P<0.05)。RhoC在TNM III/IV期的NSCLC组织中阳性表达率为68.9%(51/74),明显高于在Ⅰ/II期NSCLC组织中阳性表达率50.6%(39/77,P<0.05);RhoC在出现淋巴结转移的表达率为49.2%(32/65),显著高于没有淋巴结转移的阳性表达率67.4%(58/86,P<0.05);非小细胞肺癌中 RhoC高表达同 Ki-67高表达呈显著正相关关系(χ2=21.634,r=0.377,P<0.01)。结论 RhoC的高表达与非小细胞肺癌的分期,淋巴结转移及增殖有关。

RhoC; Ki67; 非小细胞肺癌; 侵袭转移

肺癌是目前全世界发病率最高的恶性肿瘤,每年新发病例数接近100万,约占癌症发病总数的12%,居各种恶性肿瘤之首,且呈逐年上升趋势,患者总的5年生存率仅为8%-11%[1]。导致肺癌患者预后不良的主要原因在于肺癌患者在发现时往往已经处于晚期,出现了癌细胞的淋巴结转移,甚至转移至远隔器官。因此,充分揭示肺癌细胞的侵袭转移机制,对于降低肺癌患者的死亡率,具有重要意义。

Ras相似蛋白C(Ras homology C,RhoC)是小分子量G蛋白超家族中Rho亚族的成员蛋白之一,近年研究表明RhoC在多种肿瘤中高表达,尤其在转移方面的作用突出,被称为肿瘤侵袭转移的分子开关[2]。本研究利用免疫组化的方法,检测组织芯片中151例非小细胞肺癌患者RhoC的表达情况,同时选用能比较客观反映肿瘤细胞增殖活性的Ki67抗原(Ki67 antigen),来探讨 RhoC和 Ki67在肺非小细胞肺癌中的表达状况及其与临床病理参数之间的关系。

材料和方法

1.肺癌组织芯片

组织芯片(共200点,组织切片直径约2mm,切片厚度4μm)购自上海生物芯片有限公司。其中男性68例,女性83例,年龄39-78岁,中位年龄62.94岁。151例为非小细胞肺癌组织(按照新WHO标准(2004),80例腺癌,71例鳞癌),另外49例为对应的正常肺组织。按2009年国际抗癌协会(UICC)制定的 TNM分期:Ⅰ期31例,II期46例,III期71例,IV期3例。有淋巴结转移86例,无淋巴结转移65例。

2.主要试剂

羊抗人 RhoC多克隆抗体(SC212116,美国Santa Cruz公司);鼠抗人单克隆抗 Ki-67抗体(即用型)、免疫组化 ElivisionTMplus试剂盒(KIT-9901)及DAB显色剂购自福州迈新公司。

3.Elivision TM plus法检测 RhoC和 Ki-67的表达

参照试剂说明书分别检测RhoC和 Ki-67的表达,组织芯片脱蜡至水,高温高压抗原修复,ElivisionTMplus法过氧化物酶阻断液孵育10 min,第一抗体 RhoC,工作浓度1/50;抗人单克隆抗体 Ki-67(即用型),4℃冰箱过夜;DAB显色,苏木精轻微衬染。同时用PBS代替一抗作染色的阴性对照,用已知的染色阳性切片作阳性对照。

4.结果判断

RhoC以细胞浆和/或细胞核呈棕黄色者为阳性细胞,选肿瘤细胞阳性染色集中区域每张切片技术高倍视野(×400)下400个肿瘤细胞。按 RhoC表达百分率分为以下四个等级:<25%为0分,26%-50%为1分,51%-75%为2分,>75%为3分。根据免疫组化染色强度分为三个等级:浅黄色计为1分,棕黄色计为2分,黄褐色计为3分。以阳性细胞率和染色强度的分值乘积作为每一例的积分。为便于统计分析,将评分结果归为阴性表达(积分<3分者)和阳性表达(积分≥3)两组。

Ki-67以细胞核呈棕黄色者为阳性细胞,观察5个视野(×200)中 Ki-67表达的肿瘤细胞占的百分比,取其均值<30%的癌细胞表达为低表达,≥30%的癌细胞表达为高表达。

5.统计学处理

采用医学统计软件 SPSS11.5进行统计分析,RhoC、Ki-67在组织中阳性表达率比较采用χ2检验。P<0.05为有统计学意义。

结 果

1.RhoC在NSCLC及癌旁组织中的表达情况

RhoC蛋白的阳性表达部位主要在细胞的胞质或胞核(见图1)。NSCLC组织的 RhoC阳性表达率为59.60%(90/151),相应癌旁组织RhoC阳性表达率为 32.7%(16/49),差别有显著意义(P<0.05)。

图1 免疫组织化学检测RhoC在肺癌组织芯片中的表达情况A.经过免疫组织化学(ElivisionTMplus法)染色后肺癌组织芯片;B.RhoC在肺鳞状细胞癌中高表达;C.RhoC在肺腺癌中高表达;Rho C高表达的肺腺癌(D)伴随着 Ki67的高表达(E)。Fig.1 The expression of RhoC in NSCLC tissue array by immunohistochemistryA.The RhoC expression in NSCLC tissue array detected by immunohistochemical staining(ElivisionTMplus method,×10);B.High expression of RhoC in squamous cell carcinoma of lung;C.High expression of RhoC in lung adenocarcinoma;High expression of RhoC in adenocarcinoma(D)is correlated with High expression of Ki67(E).

2.RhoC在NSCLC的表达与临床病理特征之间的关系

如表 1所示,RhoC在 TNM III/IV期的NSCLC组织中阳性表达率为68.9%(51/74),明显高于在Ⅰ/II期NSCLC组织中阳性表达率50.6%(39/77,P<0.05);RhoC在出现淋巴结转移的表达率为49.2%(32/65),显著高于没有淋巴结转移的阳性表达率 67.4%(58/86,P<0.05);RhoC表达与性别、年龄、部位、肿块大小和分化程度无明显相关性。

表1 RhoC在NSCLC中的表达及与临床病理特征的关系Table 1 The expression and clinical pathological significance of RhoC in NSCLC

3.RhoC的表达与核增殖抗原 Ki-67之间的关系

如表2所示,经χ2检验分析,非小细胞肺癌中RhoC高表达同 Ki-67高表达呈显著正相关关系(χ2=21.634,r=0.377,P<0.01)。

表2 RhoC的表达与核增殖抗原 Ki-67的关系Table 2 The relationship of RhoC and Ki-67 expression in NSCLC

讨 论

RhoC是小 GTP激酶家族的重要成员,主要参与肌动蛋白细胞骨架的构建、以及细胞增殖、游走等生命过程,并在细胞周期调控及包括基因转录在内的许多事件中起关键作用。近年来研究发现RhoC在多种肿瘤,如如浸润性乳腺癌、前列腺癌、头颈部鳞癌、肝癌中高表达,并参与了细胞恶性转化、浸润转移和血管发生[4-7]。

本研究应用免疫组织化学方法检测了151例组织芯片中非小细胞肺癌及癌旁肺组织中RhoC的蛋白表达,发现RhoC蛋白在肺癌组织中的表达水平显著高于癌旁肺组织,提示高表达的 RhoC蛋白可能与肺癌的进展关系密切;而RhoC高表达与肺癌的淋巴结转移、肿瘤临床分期显著相关,这可能是由于RhoC的高表达活化了相关的下游蛋白,使得肌动蛋白收缩丝组装并与粘着斑复合物结合,增强了细胞的运动能力,最终导致肺癌细胞的向淋巴结转移。

Ki67是一种贯穿表达于增殖期细胞的核抗原,其表达于除 G0及 G1早期外的其它各期,其表达变化能比较客观地反映肿瘤细胞的增殖活性。Wang H等人的研究结果表明[8],应用siRNA技术干扰结肠癌细胞系中RhoC的表达后显著抑制了肿瘤细胞的增殖能力。为了从蛋白水平研究RhoC与肺癌细胞增殖的关系,本实验通过联合检测RhoC、Ki67在非小细胞肺癌中的表达,首次探讨RhoC在肺癌中的表达是否与细胞增殖有关。结果显示肺癌组织中RhoC与 Ki67的高表达存在明显相关性(r=0.377,P<0.01),提示 RhoC可能参与细胞周期的调控而促进肿瘤细胞的增殖,说明RhoC的高表达参与肺癌的发展过程。但是RhoC促进细胞增殖的机制及参与调控细胞增殖的途径目前还不十分清楚。

综上所述,RhoC的过度表达在非小细胞肺癌的发生发展过程中具有重要的作用,可能由于RhoC的过表达,使肺癌细胞获得了更强的增殖和运动能力,从而促进肺癌的恶性生物学行为。

[1]Yang L,Perkin DM,Li LD,et al.Estimation and pro

jection of the national profile of cancer mortality in China:1991-2005.Br J Cancer,2005,90(11):2157-2166

[2]Wang ZN,Xu HM,Jiang L,et al.Positive association of RhoC gene overexpression with tumour invasion and lymphatic metastasis in gastric carcinoma.Chinese Med J,2005,118(6):502-504

[3]Gerdes J,Lemke H,Baxsch H,et al.Cell cycle analysis of a cell proliferation-associated human nuclear antigen defined by the monoclonal antibody Ki-67.J Immunol,1984,133(4):1710-1715

[4]Shi Z,Chen ML,He QL,et al.Antisense RhoC gene suppresses proliferation and invasion capacity of human QBC939 cholangiocarcinoma cells.Hepatobiliary Pancreat Dis Int,2007,6(5):516-520

[5]Faried A,Faried LS,Kimura H,et al.RhoA and RhoC proteins promote both cell proliferation and cell invasion of human oesophageal squamous cell carcinoma cell lines in vitro and in vivo.Eur J Cancer,2006,42(10):1455-1465

[6]Faried A,Faried LS,Usman N,et al.Clinical and prognostic significance of RhoA and RhoC gene expression in esophageal squamous cell carcinoma.Ann Surg Oncol,2007,14(12):3593-3601

[7]Karlsson R,Pedersen ED,Wang Z,et al.Rho GTPase function in tumorigenesis. Biochim Biophys Actam,2009,1796(2):91-98

[8]Wang H,Zhao G,Liu X,et al.Silencing of RhoA and RhoC expression by RNA interference suppresses human colorectal carcinoma growth in vivo.J Exp Clin Cancer Res,2010,29(1):123

Expression and clinical significance of RhoC and ki-67 in non-small-cell lung cancer

Fang Changqing,Tang Na,Yang Qingsong1,Li Miao2,Wang Yelin,Li Jianhua＊

(Department ofPathology,China Medical University and Department ofPathology,The First A f f iliated Hospital of China Medical University,S henyang,110001;1Department of Radiology,The Forth Hospital ofFushun,Fushun113123;
2Department ofPathology,The Second A f f iliated Hospital of L iaoning Tradition China Medical University,S henyang,110034,China)

Objective To explore the expression and significance of RhoC,Ki-67 in non-smallcell lung cancer.Methods The expressions of RhoC and Ki-67 in 151 specimens of lung cancer were detected by immunohistochemistry in tissue microassay.Results The expression of RhoC was detected in 90 of the 151(59.60%)human lung cancer tissues,significantly higher than that in normal lung tissues,which was only in 16 of the 49 cases(32.7%). The positive expression of RhoC was higher in advanced TNM stages(III+IV)of NSCLC,than in lower stages(I+II)(P<0.05).A correlation between RhoC expression and lymph node metastasis was found in our study(P<0.05). Besides,we also found that the overexpression of RhoC was positively correlated with Ki67 in NSCLC(χ2=21.634,r=0.377,P<0.01). Conclusion The overexpression of RhoC is correlated with advanced TNM stage,lymph nodal metastasis and proliferative ability of NSCLC.

RhoC; Ki67; Non-smallcell lung cancer; Invasiveness

R743.2

A

10.3870/zgzzhx.2011.02.012

2010-11-15

2011-02-01

辽宁省科学技术厅资助 (20082077)

方长清,男(1968年),汉族,副主任技师。

＊通讯作者(To whom correspondence should be addressed)