基于酶固定的新型抗坏血酸传感器的研究

刘文娟,崔 淼,刘巧玲,王海霞,樊 丽,双少敏,董 川

（山西大学环境科学与工程研究中心，山西太原030006）

0 引言

L-抗坏血酸(如图1所示)是一种人体必需的维生素，也是一种抗氧化剂，可提高人体的免疫力及反应能力。有研究表明，人体内缺乏L-抗坏血酸会导致黄褐斑、牙龈肿胀、粘膜出血等[1]。但是其在人体内无法自身合成，所以从食物和药物中摄取就成为获取L-抗坏血酸的重要途径。简便、快速、准确地对抗坏血酸进行检测具有十分重要的意义。传统抗坏血酸的检测方法主要有电化学法[2]、分光光度法[3]及色谱法[4]等。而这些方法选择性较差、操作复杂、干扰严重。

以固定化酶为特征的传感器具有反应快、选择性好、灵敏度高等优点，是目前研究较多的生物传感器之一。

图1 抗坏血酸结构式Fig.1 Structure of L-ascorbic acid

在组装酶生物传感器的过程中，酶的固定和稳定性是很重要的。许多不同的固体材料可以作为固定化酶的载体，通常，固定化方法主要有物理包埋法、吸附法、化学交联法、共价键合法等。由于鸡蛋膜使用简单、透气性好、及生物兼容性好是酶的优良载体，已应用于酶的固定化。Wu等[5]，将葡萄糖氧化酶固定于鸡蛋膜检测葡萄糖，灵敏度、稳定性等得到了满意的结果。Matsumoto等[6]将抗坏血酸氧化酶固定于胶原膜，研制了抗坏血酸生物传感器，检测范围宽，灵敏度高。但是由于固定的酶容易脱落，所以这种抗坏血酸传感器的使用寿命较短，重现性较差。

该文采用物理包埋和化学交联相结合的固定化酶的方法，选取壳聚糖作包埋剂，戊二醛为交联剂，将抗坏血酸氧化酶固定在鸡蛋膜表面。L-抗坏血酸在抗坏血酸氧化酶(A.O)作用下经氧气氧化生成脱氢抗坏血酸和水。通过氧电极检测反应中消耗氧气的量来测定抗坏血酸含量。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Pasco Cl-6542氧电极 (Roseville,CA,USA)，Science Workshop 500 interface数据处理系统(Pasco Scientific,Roseville,CA,USA)，JB-2型恒温磁力搅拌器及PHS-3C型酸度计(上海雷磁仪器厂)。

抗坏血酸氧化酶 (Sigma，活力为1620 U/mg protein)，L-抗坏血酸 (北京化工厂)， 壳聚糖(Sigma，脱乙酰度为 75%～85%)，戊二醛（天津瑞金特化学品有限公司，质量分数为50%），Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液(0.1 mol/L)。所有化学试剂均为分析纯，实验用水为去离子水。

1.2 酶电极的制备

准确称取一定量的壳聚糖于烧杯中，加入10 mL 0.05 mol/L HCl溶液，加热（80～90 ℃）溶解。然后将溶液冷却至室温，滴加0.1 mol/L NaOH溶液至pH=5.0，用直径为35 mm的滤纸过滤得质量浓度为0.3%的壳聚糖澄清溶液。称取2 mg抗坏血酸氧化酶溶于28 μL 0.1 mol/L磷酸缓冲溶液，将制得的酶溶液在4℃下保存。

取一个新鲜的鸡蛋壳，小心地剥离蛋膜，用去离子水清洗干净后将鸡蛋膜裁成直径1.5 cm左右的圆片，依次在膜上滴加5 μL酶溶液和100 μL壳聚糖溶液，数分钟后滴加2 μL质量分数为50%的戊二醛，用玻璃棒轻轻地将溶液在鸡蛋膜表面搅匀。室温下放置8 h晾干，置于冰箱中冷藏过夜。 用磷酸缓冲溶液(0.1 mol/L，pH=5.0)冲洗数次，洗掉未固定的酶，将酶膜紧贴在氧电极的表面，用“O”形圈固定即制得抗坏血酸酶电极。

1.3 测定方法

将制备好的抗坏血酸酶电极浸入5 mL 0.1 mol/L被空气饱和的磷酸盐缓冲溶液(pH=5.0)中，在搅拌条件下加入一定量0.1 mol/L抗坏血酸标准溶液和待测溶液。电极电位变化被输入计算机的数据处理系统中，并以溶解氧浓度变化的形式输出。记录溶解氧浓度的下降曲线，用标准曲线法测定抗坏血酸的含量。

2 结果与讨论

2.1 抗坏血酸传感器的响应行为

抗坏血酸氧化酶可选择性地将抗坏血酸催化氧化成脱氢抗坏血酸，伴随着溶液中氧气的消耗，如反应式（1）所示，氧电极作为换能器检测氧气的消耗量，根据溶解氧浓度的降低作为传感器的分析检测信号。抗坏血酸浓度的连续改变可以在传感器上产生典型的响应曲线，如图2所示，获得了抗坏血酸浓度和溶解氧浓度下降值之间的线性关系，校准曲线如图2内插图所示。

2.2 戊二醛作交联剂与未使用戊二醛制得酶膜的响应信号比较

图2 抗坏血酸生传感器对不同浓度的抗坏血酸溶液的响应曲线加入 0.10 mol/L 葡萄糖标准溶液体积为(0)0.0、 (1)1.0、 (2)3.0、 (3)5.0、 (4)7.0、 (5)10.0、 (6)15.0 μLFig.2 Typical response curve of the ascorbic acid biosensor at pH5.0 phosphate buffer(100 mmol/L)after each successive addition of various volume of 0.10 mol/L ascorbic acid standard

取两个鸡蛋膜，膜a以壳聚糖做包埋剂、戊二醛为交联剂固定酶，膜b只采用壳聚糖作连接剂固定等量的酶，分别覆盖于氧电极表面，制备抗坏血酸传感器。在相同实验条件下记录溶解氧浓度下降曲线。从图3中可看出，相同条件下采用膜a制得的传感器测得的溶解氧浓度下降值更大，说明戊二醛作为交联剂，能够减少酶的脱落，减少测定误差。

图3 戊二醛作交联剂与未使用戊二醛制得酶膜的响应信号比较Fig.3 Comparison of the performance of two kinds of biosensors with ascorbate oxidase immobilized eggshell with or without glutaraldehyde as cross-linking agent

2.3 温度的影响

移取5 mL磷酸缓冲溶液置于温度依次为10、20、30、40、50 ℃的恒温水浴中，分别加入等量抗坏血酸标准溶液，记录溶解氧浓度下降曲线。结果表明，随着温度升高，溶解氧浓度的下降值增大。说明酶在较高温度下，能够获得较大反应活性，使酶促反应过程中氧消耗的速率加快，溶解氧浓度的改变信号较大。尽管温度升高有利于加快酶促反应速率，但考虑到长期处于高温环境容易使酶失活而减少使用寿命。因此，实验以室温作为适宜的温度。

2.4 溶液pH的影响

在pH为4.0～8.0的磷酸缓冲溶液中，分别加入 25 μL 0.10 mol/L L-抗坏血酸标准溶液，记录溶解氧浓度下降曲线，结果显示，最佳pH为5.0；在 pH 为 4.0～8.0 之间，该传感器仍可以保持其最佳响应值的90%以上。当pH值大于7时，响应值明显降低。这可能是由于抗坏血酸的Pka1值为4.17，pH值过高使其脱氢生成较稳定的烯醇式结构，而相邻的双键使得这种结构更加稳定，同时脱氢抗坏血酸迅速转变成两种可能的二酮结构。因此实验中采用pH为5.0的缓冲溶液进行实验。

2.5 戊二醛的质量分数的影响

以戊二醛的质量分数分别为 2.5%，5.0%，10%，15%，17.5%和20%制作五种类型酶膜，覆盖于氧电极表面制成不同抗坏血酸传感器，在相同实验条件下测定溶解氧浓度的下降值。结果表明，当戊二醛的质量分数在2.5%～15%范围内，电极响应随着戊二醛的质量分数增加而增大；当戊二醛的质量分数大于15%时，电极响应随戊二醛质量分数增加而明显减小。可能的原因[5,7]是戊二醛含有细胞毒素，有一定生物毒性，高质量分数戊二醛可能使酶部分失活，而导致传感器灵敏度下降。因此实验中采用质量分数为15%的戊二醛为交联剂。

2.6 酶固定量的影响

在五个干净的鸡蛋壳膜上，分别滴加含酶量为 2，3，4，5，6，7 Units的酶溶液，制备一系列酶膜，并与溶解氧电极偶联制得抗坏血酸生物传感器。 在 5 mL 磷酸缓冲溶液(0.1 mol/L，pH=5.0)中加入一定量的抗坏血酸标准溶液，记录溶解氧浓度下降值（结果见表1）。从表1可看出：酶固定量在2～6 Units，溶解氧浓度的下降值随酶量的增加而急剧增大，而当酶固定量大于6 Units时增加幅度减小，可能是由于作为交联剂的戊二醛用量限制了酶的最大固定量的缘故。所以实验采用每张膜固定6 Units抗坏血酸氧化酶为最佳酶用量。

表1 酶固定量对传感器响应性能的影响Tab.1 Interference effect of ascorbic acid biosensor

2.7 传感器分析性能的测定

在 5 mL 磷酸缓冲溶液 （0.10 mol/L pH=5.0）中测定0.50 mmol/L抗坏血酸标准溶液，记录从加样到溶解氧浓度达到基本平衡时的值，平均响应时间约为80 s。

该传感器的线性回归方程为y=4.608 23 x+0.091 17(r2=0.999 0),抗坏血酸浓度在 0.02～0.82 mmol/L之间呈良好的线性关系（如图2所示）。以3倍信噪比值计算传感器的检测限为12 μmol/L。对0.50 mmol/L的抗坏血酸溶液重复测定20次，RSD＝3.32%。

以0.5 mmol/L抗坏血酸标准溶液每隔2～3 d测定传感器的响应情况。将修饰的膜浸泡于磷酸缓冲溶液中置于4℃的冰箱中，待用。约90 d后，取出膜，实验结果表明响应值降低为初始值的87.6%，表明该传感器具有良好的使用寿命。

2.8 干扰实验

该实验对实际样品中可能存在的干扰物质是否产生干扰进行了考察，并换算成产生相同的响应信号时L-抗坏血酸的含量（表2）。对于含有Vc的实际样品，可能存在的干扰物有D-葡萄糖、柠檬酸钠、苯甲酸钠、D-果糖、淀粉、山梨酸钾及CaCl2。结果表明，实际样品中可能存在的干扰物质对抗坏血酸含量的测定几乎不产生干扰。

表2 干扰物质的影响Tab.2 Effect of potential interferents on the ascorbic acid biosensor

2.9 实际样品的检测

采用该文提出的方法对市售的2种维生素C片中的抗坏血酸含量进行检测，将结果与碘量法所得结果作了比较，并进行了回收实验。结果（见表3）表明，此生物传感器法较传统碘量法更加简便、快速，可以对维生素C补充剂中的抗坏血酸含量进行准确、快速的检测。

表3 实际样品测定结果Tab.3 Results of determination of ascorbic acid in real samples

3 结论

该方法研制的抗坏血酸生物传感器具有检测范围更宽、响应时间更短、灵敏度更高，为食品中抗坏血酸的检测提供了一种快捷、简便、可靠的新方法。

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