NET-1、EGFR在肺癌中的表达及意义

江苏省盐城市第一人民医院（224001）卞伟钢 胡平 宋曙 何啸 王传斌 陈萍

南通大学（226001）陈莉

NET-1(new EST tetraspan numbered 1)是由Serru等[1]于2000年在EST数据库中发现的7个新的含四个跨膜区域蛋白超家族(TM4SF)的成员，是一个肿瘤增殖相关蛋白，在细胞信号转导、调节、粘附、移动、增生和分化中起重要作用。已有报道，在多种恶性肿瘤中存在NET-1基因的异常表达[2～4]。表皮生长因子（EGFR）属于表皮生长因子家族（erbB家族）成员之一[5]，其异常表达参与了肿瘤细胞的增殖、肿瘤血管生成、粘附、侵袭、转移等过程。NET-1与EGFR在肺癌的发生、恶性进展中是否发生了协同作用，在国内外的研究中尚未见报道。

1 临床资料

1.1 病例与标本 收集2004年1月～2006年12月盐城市第一人民医院、盐城市肿瘤医院、盐城市第三人民医院手术切除的肺癌组织标本120例。全部病例均行常规病理检查，明确诊断与临床分期。120例标本中，男性84例，女性36例，男、女比例为1:0.43；年龄34～78岁，中位年龄60岁，小于60岁的有51例，大于60岁的有69例。全部病例术前均未接受过化疗及放疗。取10例肺癌周边相对正常的肺组织作为对照组，所有组织均用10%福尔马林固定，常规石蜡包埋，连续切片，作HE及免疫组化染色。

1.2 主要试剂 兔抗人多克隆抗体NET-1由南通大学医学院病理教研室惠赠，美国旧金山基因生物公司协助合成，鼠抗人单克隆抗体EGFR、SP免疫组化检测试剂盒购自福州迈新生物技术公司。

1.3 免疫组织化学方法 常规脱蜡水化，组织抗原微波修复，10%山羊血清封闭。NET-1抗体的工作浓度为1:20，EGFR抗体的工作浓度为1:50，免疫组化染色SP法按说明书操作步骤进行，DAB-H2O2显微镜控制下显色，苏木精复染，常规脱水中性树胶封片。使用PBS代替一抗处理的切片作为阴性对照，已知阳性组织切片作为阳性对照。

1.4 结果判断 NET-1阳性染色定位于肺癌细胞的细胞质或细胞膜上，呈棕黄色颗粒，对阳性表达采用半定量积分法判断，阳性细胞数<5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。染色强度呈淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分。阳性细胞百分比和染色强度两项积分相乘，0分为(-)，1～4分为(+)，5～8分为(++)，9～12分为(+++)[6]。EGFR的阳性染色定位于肿瘤细胞的胞质或胞膜上、个别位于胞核上呈棕黄色颗粒。光镜下选择5个表达EGFR相对较多的区域，在高倍镜视野下每个视野分别计数200个细胞，共计1000个细胞，按阳性细胞数占肿瘤细胞的比例进行分级：阴性（-）为无棕黄色染色或染色阳性肿瘤细胞数<10%；弱阳性（+）为阳性细胞数 10%～<25%；中等阳性（++）为阳性细胞数 25%～<50%；强阳性（+++）为阳性细胞数≥50 %。

1.5 统计学处理 应用spss11.5英文版统计分析软件对相关数据进行统计处理。率的比较采用x2检验和Fisher-exact检验，对影响生存预后的联合效应采用 Cox比例风险模型进行多因素分析，纳入的变量为性别、年龄、病变部位、临床分期、病理分化程度、淋巴结转移，采用Spearman等级相关分析两指标间的关系。P<0.05有统计意义，所有检验和 P均为双侧。

2 结果

2.1 对照组与肺癌组NET-1、EGFR表达情况的比较 NET-1阳性表达于肺癌细胞的细胞质或胞膜上，EGFR阳性表达于肺癌细胞的细胞质或核膜上（附图1～4）。120例肺癌中，NET-1、EGFR阳性率分别为85.00%（102/120）、69.16%（83/120）；对照组10例中阳性率分别为40.00%（4/10）、10.00%（1/10）。经统计学处理，肺癌组与对照组之间NET-1、EGFR的表达差异有统计学意义（χ2=13.0842，P=0.004；χ2=14.6362，P=0.002）。见附表1。

附表1 NET-1、EGFR在肺癌组与对照组中表达的比较

2.2 肺癌组织中NET-1、EGFR的表达与临床病理因素的关系 肺癌组织中NET-1、EGFR的表达与肿瘤的临床分期、分化程度及有无淋巴结转移有关（P<0.05），而与患者性别、年龄、病变部位无显著相关（P>0.05）。见附表2。

2.3 肺癌组织中NET-1、EGFR表达的关系笔者配对观察了120例肺癌组织中NET-1、EGFR表达的情况，结果发现两者同时为强阳性表达者20例，同时为阴性表达者11例，两者的表达有相关性（χ2=51.8097，P=0.000），进一步做spearman等级相关分析，结果发现两者在肺癌中的表达呈正相关（r=0.6107，P=0.000）。见附表3。

附表2 NET-1、EGFR的表达与肺癌临床病理因素的关系

附表3 NET-1、EGFR在肺癌组织中表达的相互关系

3 讨论

四聚体超家族（TM4SF）是一组含有4个疏水性跨膜结构域的蛋白，在细胞外形成两个大小不等的环状结构，氨基端和羧基端位于胞浆内。长度较短。这些分子之间有很多高度保守的序列，并且大多数同源性序列都位于跨膜区域[7]。从1990年发现至今，TM4SF的成员已发展到了25个，NET-1基因是TM4SF家族成员之一，定位于1p34.1，其mRNA全长为1297bp，编码序列为128-853bp，有241个氨基酸的开放阅读框[1]。陈莉等[8]通过RT-PCR技术筛检人类48种组织与相应肿瘤，发现除造血系统组织与相应肿瘤、心、脑、胰不表达外，几乎所有的人类组织及相应肿瘤均表达NET-1基因。本研究结果显示，NET-1基因在肺癌组织与正常肺组织中表达的差异有统计学意义，且在临床分期晚、分化程度低、有淋巴结组的表达水平显著升高，提示NET-1作为一种胞质蛋白可能可以传导细胞分裂的信息和/或引起细胞异向分化或去分化，它的过度表达与细胞增殖有关，可明显上调肺癌的恶性进展过程。

附图1 低分化腺癌NET-1高表达阳性定位于癌细胞质（SP×400）

附图2 低分化鳞癌NET-1高表达阳性定位于癌细胞质（SP×400）

附图3 低分化腺癌EGFR高表达阳性定位于癌细胞质与核（SP×400）

附图4 高分化鳞癌EGFR高表达阳性定位于癌细胞质（SP×400）

EGFR是一个由原癌基因c-erbB-1编码的相对分子质量为 170000的跨膜糖蛋白，是一种细胞膜表面的糖蛋白受体，具有酪氨酸激酶活性，广泛分布于除成熟骨骼肌细胞、体壁内胚层和造血组织以外的所有组织细胞。已有研究发现在多种肿瘤组织中存在EGFR的高表达[9][10]。本研究发现，肺癌组织中EGFR蛋白的表达较正常组织明显升高，且在低分化、高分期有淋巴结转移的病例中EGFR表达显著高于高分化、低分期、无淋巴结转移的病例，与文献报道一致。由于酪氨酸激酶是细胞信号传导的必要条件，因此，笔者认为在肺癌组织中EGFR与其配体结合后使得酪氨酸激酶磷酸化而激活酪氨酸激酶，通过催化与肌醇磷脂代谢有关的酶、激酶，调节蛋白磷酸化，促进产生第二信使，导致核内原癌基因c-myc、c-fos表达刺激肺癌细胞发生增殖，与肺癌的恶性进展密切相关。

尽管TM4SF蛋白的生物学功能不十分清楚，但有报道认为TM4SF与细胞粘附分子整合素的协同作用可特异性地调控后配体整合素依赖性信号转导：影响粘附依赖性下游信号转导事件，包括细胞蛋白的酪氨酸激酶的磷酸化和丝氨酸、苏氨酸激酶PKB/c.Akt的激活，进而影响细胞的运动和分化。笔者对肺癌组织中NET-1与EGFR的表达进行了相关分析，结果提示两者呈正相关，因此猜测在肺癌的发生、恶性进展中，EGFR作为一种酪氨酸激酶受体在其活化途径中有受到TM4SF蛋白影响的可能性，两者可协同调节肺癌细胞的恶性转化与增殖。本研究结果显示NET-1和EGFR在肺癌的发生、恶性进展中发挥了不可或缺的作用，且可能存在协同作用，因此二者联合检测可作为评估肺癌恶性程度指标。