5,7-DMF对MDA-MB-453细胞凋亡和14-3-3σ基因表达的影响

刘胜姿，刘英姿，全梅芳，谭宇婷，周 源

（湖南师范大学医学院，湖南 长沙 410013）

白杨素是从多种植物、蜂胶和蜂蜜中提取的一种具有广泛生物活性的黄酮类化合物，实验证明白杨素具有广谱抗肿瘤活性，但因其在肠道吸收甚少，并且5,7-位羟基在体内易被迅速糖基化代谢以致活性降低，使其临床应用受到限制[1]。有研究显示，无羟基的黄酮结构分子能有效促进HT-29细胞的分化和凋亡[2]，证明羟基并不是白杨素抗肿瘤作用所必须的基团。Wen等证明，多酚类化合物甲基化后肠道吸收率更高，肝代谢更稳定，更有利于开发成有效的抗癌药物[3]。我们先前的实验研究也发现，与先导化合物白杨素相比，5,7-二甲氧基白杨素对体外培养的人胃癌SGC-7901细胞和人结肠癌HT-29细胞生长具有更强的抑制作用[4]。

14-3-3σ是14-3-3蛋白家族中的一个成员，作为一个细胞周期负调控因子，14-3-3σ的活化可以引起细胞周期G2/M期阻滞从而发挥抑癌基因的作用[5]。而14-3-3σ基因的缺乏或甲基化失活在乳腺癌的发病中起着重要作用[6]。我们的预实验表明，MDA-MB-453细胞株为一株14-3-3 σ基因甲基化失活的人乳腺癌细胞株。本文旨在研究自主设计合成的新型白杨素类似物5,7-DMF诱导人乳腺癌MDA-MB-453细胞凋亡作用，并探讨其调控过程是否与DMF通过表观遗传学机制抑制14-3-3σ基因甲基化和上调14-3-3σ蛋白表达，复活14-3-3σ基因功能有关。

1 材料与方法

1.1 试剂

5,7-二甲氧基黄酮 (5,7-DMF,Sigma公司;分子量:282,性状:白色粉末,纯度：98%)；5-氮杂胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-CdR,Sigma公司)；碘化丙啶(PI,Sigma 公司)；TRIzol(美国 Invitrogen公司)，基因组提取和逆转录试剂盒 (美国Promega公司)，14-3-3σ 和 β-actin 单克隆抗体(美国 Santa Cruz公司)。

1.2 细胞培养

人乳腺癌MDA-MB-453细胞购于中国典型培养物保藏中心（中国武汉市），用含10%小牛血清的DMEM培养基，加100 U/mL青霉素，100 U/mL链霉素，置于37℃，5%CO2及饱和湿度培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。

1.3 流式细胞术分析

按照先前文献[7]的方法进行，用EPICS XL型流式细胞仪(美国COULTER公司)测定10000个细胞的DNA含量，SYSTEM II软件分析细胞凋亡率。

1.4 基因组DNA提取

按A1120试剂盒说明书操作(美国Promega公司)，DNA纯化后，在紫外分光光度A260/280处检测，计算其纯度和含量。样品于-20℃保存。

1.5 甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)

按照文献[8]报道合成引物，甲基化引物(M)上游：5'-TGGTAGTTTTTATGAAAGGCGTC-3'，下游：5'-CCTCTAACCGCCCACCACG-3'，产物片段105 bp，非甲基化引物(U)上游：5'-ATGGTAGTTTTTATGAAAGGTGTT-3'， 下 游 ：5'-CCCTCTAACCACCCACCACA-3'，产物片段107 bp。反应体系及反应条件按文献[8]的方法进行，产物经2%琼脂糖凝胶电泳验证。

1.6 逆转录PCR(RT-PCR)检测

TRlzol提取总RNA和逆转录cDNA的合成按试剂盒说明书操作。

用prime primier 5.0软件自行设计 14-3-3σ引物 (上游：5'-TGCGAAGAGCGAAACCTGC-3'，下游：

5'-CTGTTGGCGATCTCGTAGTGG-3'，产物片段446 bp)和内参照β-actin引物(上游：5'-CCCTGGACTTCGAGCAAGAGAT-3'，下游：5'-GATTTTCTGCGCAAGTTAGG-3'，产物片段 520 bp)。反应体系及反应条件按文献[9]的方法进行，产物经1%琼脂糖凝胶电泳验证。

1.7 Western blotting分析

Western blotting分析按照先前文献[7]描述的方法完成。抗人14-3-3σ和β-actin单克隆抗体作为一抗。用增强型ECL蛋白质印迹分析系统进行目的条带信号的检测。

1.8 统计学分析

实验数据录入SPSS 15.0 for windows evaluation软件，建立数据库，各组实验数据均用均数±标准差(mean±SD)表示，用One Way ANOVA行方差分析。P＜0.05为统计学意义显著标准。

2 结果

2.1 5,7-DMF对人乳腺癌MDA-MB-453细胞活性的影响

MTT 比色测定结果表明，0.1～30.0 μmol/L 的5,7-DMF显著抑制人乳腺癌MDA-MB-453细胞增殖活性,其抑制作用随浓度的增加而增强。5,7-DMF(10.0 μmol/L)对乳腺癌 MDA-MB-453 细胞的抑制作用较同浓度的去甲基化药物5-Aza-CdR强(表 1)。

2.2 5,7-DMF对人乳腺癌MDA-MB-453与MCF-7细胞凋亡率的影响

表1 5,7-DMF对人乳腺癌MDA-MB-453细胞活性的影响(mean±SD,n=3)

PI染色FCM分析结果显示，5,7-DMF (5、10和20 μmol/L)处理 48 h，以浓度依赖的方式诱导MDAMB-453细胞凋亡率增加 (表2)。其作用效价强度大于5-Aza-CdR。

表2 5,7-DMF对人乳腺癌MDA-MB-453细胞凋亡率的影响(mean±SD,n=3)

2.3 5,7-DMF抑制人乳腺癌MDA-MB-453细胞14-3-3σ基因甲基化

如图 1所示，10 μmol/L 5,7-DMF与 5-Aza-CdR分别处理72 h，均能有效抑制MDA-MB-453细胞14-3-3σ基因甲基化。

图1 5,7-DMF抑制人乳腺癌MDA-MB-453细胞14-3-3σ基因甲基化

2.4 5,7-DMF上调人乳腺癌MDA-MB-453细胞14-3-3σ基因mRNA表达水平

如图 2所示，10 μmol/L 5,7-DMF 与 5-Aza-CdR分别处理72 h，均能显著提高MDA-MB-453细胞14-3-3σ基因mRNA表达水平。

图2 5,7-DMF上调人乳腺癌MDA-MB-453细胞14-3-3σ基因mRNA表达

2.5 5,7-DMF上调人乳腺癌MDA-MB-453细胞14-3-3σ蛋白表达水平

如图3所示，5,7-DMF(1,5,10μmol/L)处理72小时，均能提高MDA-MB-453细胞14-3-3σ蛋白表达水平，并呈浓度依赖性，其中10 μmol/L 5,7-DMF作用效果与同浓度5-Aza-CdR相当。

图3 5,7-DMF上调人乳腺癌MDA-MB-453细胞14-3-3 σ 蛋白表达

3 讨论

有资料显示，乳腺癌已成为全球妇女发病率最高的恶性肿瘤[1]，我国乳腺癌的发生率也呈逐年上升趋势。目前，治疗乳腺癌的方法主要有：手术、化疗、放疗、内分泌治疗。而化学药物治疗在乳腺癌综合治疗中仍然占主导地位，但因其严重的毒副作用极大地降低了它的临床应用价值。因此，寻找乳腺癌特异性肿瘤分子标志以及高效、低毒的新的分子靶向治疗药物具有重大的社会效益和临床应用前景。

14-3-3σ是人类乳腺上皮的一个特异性标记，它的表达可介导DNA损伤通过p53依赖途径所诱导[10]。当DNA发生损伤后，p53被激活磷酸化，磷酸化的p53可以和14-3-3σ启动子上游长度为1.8kb的转录起始位点结合，从而诱导14-3-3σ的表达，引起细胞周期G2/M期阻滞，抑制细胞的生长。Yang等研究表明，14-3-3σ可以稳定p53的表达并且增加p53的转录活性，提示p53和14-3-3σ之间存在着一个正反馈调节通路[11]。在乳腺癌的发病进程中频繁出现14-3-3σ基因缺乏或其表达下调[10]。可见14-3-3σ基因的低表达在乳腺癌的发病中起着重要作用[6]。

通过本文的研究，我们证明自主设计合成的新型白杨素类似物5,7-DMF以浓度依赖的方式抑制人乳腺癌MDA-MB-453细胞活性并诱导细胞凋亡。为了阐明5,7-DMF诱导凋亡的分子机制，我们分析了5,7-DMF处理24 h的MDA-MB-453细胞中14-3-3σ基因的甲基化、mRNA和蛋白表达水平，证明5,7-DMF通过通过表观遗传学机制即抑制14-3-3σ基因甲基化和上调14-3-3σ mRNA和蛋白表达，复活14-3-3σ基因功能，从而抑制MDA-MB-453细胞系生长和诱导细胞凋亡。总之，5,7-DMF能抑制人乳腺癌MDA-MB-453细胞生长并诱导细胞凋亡，这与其抑制14-3-3σ基因甲基化和上调14-3-3σ蛋白表达有关。

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