柚皮苷抗炎镇痛作用的实验研究

谢仁峰，文双娥，李 洋，左 灿，张坚松

（湖南师范大学医学院，湖南 长沙 410006）

柚皮苷(naringin)是一种主要存在于芸香科植物葡萄柚、橘、橙的果皮和果肉中的双氢黄酮类化合物，也是中药骨碎补、枳实、枳壳、化橘红等的主要有效成分之一[1]，具有多种独特的生物学活性和药理作用[2]。近年的研究表明，柚皮苷具有抗氧化、抗肿瘤、抗辐射作用，抑制肿瘤坏死因子(TNF-a)的释放、抑菌作用，影响胆固醇生物合成等[3-9]。本研究采用四种急性炎症动物模型，观察柚皮苷的抗炎、镇痛作用及机制。

1 材料与方法

1.1 动物

昆明种健康雄性小鼠，体重18～22g；SD雄性大鼠，体重180～220g，购自长沙市开福区东创实验动物科技服务部，许可证号：SCXK(湘)2009-0012。

1.2 药品

95%柚皮苷 (批号23616,aladdin-reagent database Inc 提供)；冰醋酸(批号 20080702，天津科密欧化学试剂有限公司)；二甲苯(批号 20100715，广东光华化学厂)；伊文思蓝(批号W201CC705，国药集团化学试剂有限公司)；阿司匹林 (批号 101001，北京生物制药股份有限公司)；氢化可的松注射液(批号 0907142，天津金耀氨基酸有限公司)。

1.2 仪器

Tu-1800SPS紫外可见分光光度计 (北京普析通用仪器责任有限公司)；YLS-Q4耳肿打耳器 (南京便诊生物科技有限公司)；游标卡尺(上海量具刃具厂)。

1.3 实验方法

1.3.1 小鼠扭体实验

昆明种雄性小白鼠50只，随机分成5组：生理盐水组(0.2 mL/10g)、阿司匹林200 mg/kg组、三个剂量(60、120和 180 mg/kg)柚皮苷组，每组 10只。分别空腹灌胃给予生理盐水、阿司匹林和柚皮苷，每天1次，连续3d。末次给药1 h后,腹腔注射1.0%冰醋酸0.1 mL/10g。观察20 min内扭体反应的次数并计算各用药组的扭体抑制率(%)。抑制率(%)= (NS组扭体均数 -用药组扭体均数)/NS组扭体均数[10-11]。

1.3.2 小鼠耳肿胀实验

昆明种雄性小白鼠50只，随机分成5组,每组10只。分别空腹灌胃给予生理盐水(0.2 mL/10g)、阿司匹林400 mg/kg、柚皮苷小剂量、中剂量、大剂量组(120、180 和 240 mg/kg)，每天 1次，连续 3 d。 末次给药1 h后，在小鼠右耳的前后两面涂布100%二甲苯(每只0.02 mL)致炎,在左耳的前后两面涂生理盐水(每只0.02 mL)做对照。致炎30 min后，脱颈处死小鼠,沿耳廓剪下双耳，用8 mm直径打孔器分别在同一部位打下耳片,用电子天平称重，计算肿胀度(肿胀度=右耳片重-左耳片重)[12-13]。

1.3.3 小鼠实验性腹膜炎实验

小白鼠50只，随机分成5组，即生理盐水组、阿司匹林(200 mg/kg)组以及小、中、大剂量柚皮苷组(30、60和120 mg/kg)，每组10只。各组小鼠分别灌胃给予生理盐水、阿司匹林和柚皮苷，每天1次，连续3d。末次灌胃给药1h后,各鼠尾静脉注射0.5%伊文思蓝生理盐水溶液0.1 mL/10g,随即腹腔注射0.6%醋酸0.1 mL/10g。20 min后脱颈椎处死小鼠，无菌操作下打开腹腔,用6 mL生理盐水分次洗涤腹腔,吸管吸出2 mL洗涤液，加入生理盐水4 mL，离心 15 min(3000 r/min)；取上清液于 590 nm处比色测定,测出每只小鼠腹腔渗入染料的吸光度(OD)值，用于判断小鼠腹腔毛细血管通透性[14-15]。

1.3.4 大鼠足趾肿胀实验

取SD雄性大鼠40只，在每只大鼠右后足趾踝关节处作一标记线，用软尺环绕此处一周，游标卡尺测出周径的长度即为踝关节的正常周长。大鼠随机分成5组：生理盐水组，氢化可的松组(30 mg/kg)，小、中、大剂量柚皮苷(60、120和240 mg/kg)组，每组 8只。每天1次灌胃，连续3 d。末次给药1 h后，在每只大鼠右后足趾向踝关节多个方向注射新鲜蛋清0.1 mL致炎，分别测量致炎后1、2、3和4 h踝关节的周长，计算肿胀度(肿胀度=肿胀后周长-肿胀前周长)。并将肿胀右足趾沿标记线剪下，剪一小块组织立即用甲醛固定做组织切片作形态学观察；将肿足剥皮，剪碎浸泡于5 mL生理盐水中1 h，离心取上清液0.1 mL加入KOH-甲醇溶液(0.5mol/L)2 mL,50℃水浴异构化20 min,再加2 mL甲醇稀释，于278 nm处比色，以OD值反映PGE2含量[16-18]。

1.4 统计学处理

实验中数据均以mean±SD表示，各组数据之间采用两样本均数的t检验,用Microsoft Excel完成。

2 结果

2.1 柚皮苷对小鼠扭体反应的影响

由表1可见，柚皮苷60、120和180 mg/kg组的扭体反应的次数依次为(20.5±6.7)次、(15.9±7.8)次和(10.0±6.7)次，与生理盐水组(30.4±7.0)次比较，柚皮苷能显著(P＜0.01或P＜0.001)减少1%醋酸所致小鼠扭体反应的次数，且呈现剂量依赖性。

表1 柚皮苷对醋酸所致小鼠扭体反应的影响 (n=10，mean±SD)

2.2 柚皮苷对小鼠致炎耳片肿胀度的影响

柚皮苷120、180和240 mg/kg组的小鼠耳肿胀度依次为(13.3±4.1)mg、(11.6±4.0)mg 和(11.7±3.7)mg，与生理盐水组(17.2±3.9)mg比较，柚皮苷能显著(P＜0.05或P＜0.01)抑制二甲苯所致小鼠耳肿胀度，且呈现一定剂量依赖性。结果见表2。

表2 柚皮苷对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响(n=10，mean±SD)

2.3 柚皮苷对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响

30、60和120 mg/kg柚皮苷组的小鼠腹腔洗涤液 OD 值依 次为 (0.105±0.031)、(0.083±0.025)和(0.079±0.019)，与生理盐水组比较，柚皮苷能显著(P＜0.001)降低小鼠腹腔洗涤液OD值，且呈现剂量依赖性。结果见表3。

表3 柚皮苷对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响(n=10，mean±SD)

2.4 柚皮苷对大鼠足趾肿胀度的影响

柚皮苷60、120和240 mg/kg组新鲜蛋清致炎1、2、3和4h后的肿胀度与生理盐水组比较，都显著(P＜0.05或P＜0.01或P＜0.001)减轻。 结果见表4和图1。

表4 柚皮苷对蛋清所致大鼠足趾肿胀的影响(n=8，mean±SD)

2.5 柚皮苷对大鼠肿胀足趾浸液PGE2含量的影响

柚皮苷60、120和240 mg/kg组的大鼠肿胀足趾浸液于278 nm处所测的OD值 (反映PGE2含量)依次为(0.058±0.014)、(0.055±0.012)和(0.060±0.009)，与生理盐水组比较，柚皮苷能显著(P＜0.05或P＜0.01或 P＜0.001)降低肿足浸液的OD278nm值，即PGE2含量。结果见表5。

表5 柚皮苷对大鼠肿胀足趾浸液PGE2含量的影响(n=8，mean±SD)

3 讨论

在急性炎症过程中，血流动力学改变、血管通透性增加和白细胞渗出改变非常明显，其中血管通透性增加引起渗出是炎症最具特征性的变化。血管扩张充血，血浆和炎性细胞渗出，局部表现为红、肿、热、痛和功能障碍；全身表现发热、白细胞和免疫细胞增多等。除了某些致炎因子可直接损伤血管内皮外，炎症反应主要是通过一系列炎症因子的作用而实现的。包括组胺、5－羟色胺、前列腺素(PG)、白细胞三烯(LT)和细胞因子等，它们与各自的受体结合，引起血管通透性增加，发热，疼痛，组织损伤等表现[19]。

本实验采用小鼠扭体反应实验、小鼠耳肿胀实验、小鼠毛细血管通透性实验和大鼠足趾肿胀实验作为急性炎症模型，系统地观察了柚皮苷的抗炎作用。实验结果表明，柚皮苷能显著减少醋酸所致的小鼠扭体反应次数，亦可显著减轻二甲苯所致的小鼠耳肿胀程度，降低醋酸所致的小鼠腹腔毛细血管通透性和新鲜蛋清所致大鼠足趾肿胀的程度，说明柚皮苷能作用于急性炎症反应过程,发挥其抗炎作用。

在炎症反应中，细胞膜磷脂在磷脂酶A2的作用下释放出花生四烯酸 (AA),AA经环氧化酶及异构酶的作用生成PGE2。PGE2是活性很强的炎症因子，纳克水平的PGE2就能引起炎症反应，扩张小血管、增加微血管的通透性、致热、吸引中性粒细胞及与缓激肽、白三烯等其他炎症介质协同作用，PG也是一种重要的疼痛介质[20-21]。本实验结果显示，经柚皮苷干预后大鼠肿胀足趾浸液PGE2含量显著降低，表明柚皮苷抗炎作用可能与其抑制炎性组织中的PGE2合成或释放有关。

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