妊娠滋养细胞肿瘤患者外周血肿瘤细胞检测方法的研究

兰 晶

(安阳市人民医院妇产科,河南安阳455000)

本文通过荧光定量逆转录-聚合酶链反应(FQRT-PCR),检测β-hCG-mRNA,建立在外周血中检出滋养细胞方法,推测妊娠肿瘤患者外周血中滋养细胞的含量,为肿瘤的发展转移做预防。

1 资料和方法

1.1 临床资料

11例患者中,绒毛膜癌6例,临床分期:Ⅰ期2例,Ⅱ期3例,Ⅲ期 1例;葡萄胎5例,临床分期:Ⅰ期1例,Ⅱ a期2例,Ⅲb期1例;Ⅳ期1例,各例均于治疗前采集外周血10 ml。非妊娠期妇女血液来自辽宁省血液中心。均为健康新鲜血液。

1.2 试剂与仪器

JAR细胞株购自中科院上海细胞库;新生牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所);IV胶原酶(美国Sigma公司);TRIZOL RNA提取液(美国Gibeo BRL公司);琼脂糖(美国Promega公司);RPNI 1640培养液(北京万域美澜科技);电泳仪及电泳槽(美国Bio伯乐公司);CO2培养箱(美国Forma公司);紫外分光光度仪(北京凯慕公司);2720 FQ-PCR仪(美国ABI公司);低温高速离心机(德国Eppendorf公司);Ficoll(上海试剂二厂);焦碳酸二乙酯;(美国BIO伯乐公司);DNase I(上海浩然生物技术公司);M-MLV逆转录系统(美国1NB公司);PCR反应体系(上海生物工程有限公司);100 bp PCR 1VIarker(英国INB公司);荧光探针由美国PE公司合成;引物由上海生物工程有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 JAR细胞加入外周血中实验模型的建立JAR细胞接种于培养瓶中,24 h后取上清液,用PBS洗后用胶原酶消化2-3 min,加10%FCS吹打成细胞悬液,对细胞进行染色调整细胞浓度至1×10/ml,至1×107/ml。取非妊娠期妇女外周血与JAR细胞混合,每管10 ml。台盼蓝染色。

1.3.2 总RNA提取 TRIZOL试剂盒提取RNA,提取的经DNaseI处理以去除总RNA基因组DNA。紫外分光光度仪测定其量及纯度。

1.3.3 引物与探针 上游引物:5-TGC CAC CCT GGC TGT GGA-3;下游引物 :5-GCG GTA GTI”GCA CAC CAC CTG-3。荧光探针序列:5-TCA CCG TCA ACA CCA CCA TCT GTG C-3。

1.3.4 荧光定量逆转录-聚合酶(FQ-RT-PCR) 逆转录合成CDNA第一链,总反应体系补充无RNase水至20 ml。37℃水浴40min,95%5min灭活逆转录酶后,立即零下20℃保存待测。FQ-PCR:总反应后补无RNase水至50 ml。在93、93.5、55℃分别反应 2 min,45 s,120 s,于PE5700 DNA扩增仪上40次循环,计算机随时分析记录,扩增结束时得出定量结果。

1.3.5 妊娠滋养细胞肿瘤病人外周血中β-hCG-mRNA的检测 11例患者外周血10 ml,测定β-hCG-mRNA,使用上述引物与探针,进行FQ-RT-PCR,同时与1.3.1中测得的13-hCG-mRNA值作比较,肿瘤细胞的含量以外标准推算。

2 结果

2.1 FQ-RT-PCR检测JAR细胞β-hCG-mRNA表达水平

JAR与探针荧光循环数呈负相关。当JAR细胞的数量递减相当于 mRNA 量的 10 、102、103、104、105、106个检测到探针荧光释放所需的循环数递增至16 、19 、21 、25 、26 、29 。Y=2.4X+27.3,r=-0.99,P≤0 001.

2.2 外周血加入JAR细胞后β-hCG-mRNA检测

当细胞数 ≥10/ml时,可以检测到 β-hCG-mRNA且细胞数目与未渗入血时相近。当细胞数＜10/ml时无法检测到细胞数。外周血加入JAR的检测效率较低。

2.3 妊娠滋养细胞肿瘤患者外周血中β-hCG-mRNA检测

11例妊娠滋养细胞肿瘤患者中有6例检测到JAR细胞。5例没有检测到。检测到的患者滋养细胞量经推算为104-106。检测到的5例患者细胞量小于104,或者是阴性。见表1。

表1 妊娠滋养细胞肿瘤患者外周血中滋养细胞的个数(例)

3 讨论

恶性肿瘤对人类健康造成严重威胁,肿瘤死亡率高的的主要原因是部分肿瘤细胞获得侵袭能力并造成远处转移[1]。妊娠滋养细胞疾病是一种与妊娠密切相关的疾病,包括绒癌、葡萄胎、侵蚀性葡萄胎和胎盘部位滋养细胞肿瘤,其本质是胎盘绒毛细胞变性或过度增生[2-4]。虽然目前肿瘤治疗有许多先进技术做为支撑,但是临床反馈肿瘤的患者的总体治愈率、生存率仍然非常低,患者的生活质量得不到提高,诊断的迟滞、肿瘤的复发和转移仍旧是造成患者死亡的主要原因。本研究以外周血为研究对象,外周血容易获得取材方便,其检测手段容易操控,对恶性肿瘤的早期诊断、早期发现、早期处理转移及预后具有很大的意义,为恶性肿瘤的诊治提供了必要的依据。

逆转录聚合酶链反应(reverse transcriptase-polymerase chain reaction,RT-PCR)在临床上广泛应用于检测突变基因的mRNA和肿瘤的表达。细胞死亡伴随着RNA在血液中迅速降解,而非细胞碎片或是游离RNA。因此在RT-PCR过程中,肿瘤细胞的发生发展情况完全可以通过检测RNA来实现。大量研究表明RT-PCR与免疫细胞化学相比较的的敏感性要高很多[3-6]。RT-PCR的优势在于能够避免PCR产物的污染,操作简便可控性能高,线性范围宽及精密度好。RNA提取效率高,精密度测试结果表明本此方法具有良好的重复性[7]。本研究线性相关性好,对于加入外周血的样品,在一定的浓度其测量值影响不大。然而,由于样品的污染是不可避免的,游离RNA和基因组DNA的存在使正常细胞表达具有一定的干扰性,RT-PCR的结果容易受假阳性的影响,不过可以通过添加脱氧核糖核酸酶和增加密度梯度来消除上述影响。核酸的检测方法敏感性较高但是特异性对结果不是很灵敏。定量RT-PCR能够使肿瘤细胞mRNA和正常细胞表达鉴别更加准确,但是由于组织特异性标志物的不足仍是目前研究中的最大难题。本研究将绒癌细胞株(JAR细胞)掺入滋养细胞外周血液中,来检测β-hCG-mRNA,以此检测值推算血液中的细胞量,并以此推算患者外周血中肿瘤细胞的量。本研究结果显示,尽管FQ-PCR法在JAR细胞表达的mRNA量检测在检测结果比较精密,但是当JAR细胞与外周血在一起后分离,只有在每10 ml血中超过103时方能检测到,而且随着JAR细胞数量的增加,FQ-PCR所要求的循环数相应的呈减少的态势,呈现比较理想的负性线性关系。

选用适当的肿瘤标志物是对肿瘤外周血液中肿瘤细胞进行检测成功与否的关键因素,本研究选用绒癌细胞株(JAR细胞)为标志物,在临床上具有一定的可行性,与以往的文献报道一致[8]。认为此种检测方法在临床上有一定的应用价值,可以考虑进行进一步的研究,以利于肿瘤工作的预防性检测工作。

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