银杏叶提取物对糖尿病大鼠肾脏组织型转谷氨酰胺酶表达的影响

邹颖刚,刘 辉,苏 青,魏海峰,于晓艳*

(1.吉林大学第二医院,吉林长春130041;2.吉林大学药学院实验药理与毒理教研室;3.吉林大学白求恩医学院解剖学系;4.长春中医药大学附属医院病理科)

近年来,有学者将银杏叶提取物(GBE)应用在糖尿病肾病的实验研究中,证明其对肾脏功能有明显保护作用[1,2],但具体机制还不清楚。本文拟探讨GBE对糖尿病大鼠肾脏组织型转谷氨酰胺酶(tTG)的影响,从细胞外基质(ECM)降解角度探讨GBE的肾脏保护机制。

1 材料与方法

1.1 动物 体重200-220 g的雄性Wistar大鼠30只,鼠龄6-8 w,由吉林大学实验动物中心提供。

1.2 主要试剂 链脲佐菌素STZ(Sigma),银杏叶提取物(2005版)(江苏徐州华康生物制品有限公司),TRIZOL(Invitrogen公司),逆转录酶SuperScriptⅡ(北京Trans Gene公司),TaqDNA聚合酶(北京 Trans Gene公司),PCR引物(上海捷瑞生物工程有限公司),兔抗大鼠tTG多克隆抗体(Sant Cruz公司),SDS-电泳试剂(Sigma)。

1.3 糖尿病(DM)模型的制备 单次腹腔注射STZ(50 mg/kg)诱发糖尿病。

1.4 动物分组 将糖尿病大鼠随机分为糖尿病组(DM)10只,银杏叶提取物组(GBE)10只,另设正常对照组(Control)10只。银杏叶提取物组(GBE)灌胃银杏叶提取物100 mg/kg体重/d。正常对照组和糖尿病组仅灌胃给予自来水,连续12 w。于实验结束前1天收集24 h尿液,双缩脲法测定尿蛋白浓度。大鼠处死后部分肾脏进行PAS染色,其余-80℃保存备用。

1.5 Western Blot检测各组大鼠肾脏tTG蛋白表达水平 用凝胶成像及分析系统分析蛋白显色的灰度值,计算tTG/GAPDH灰度比值。

1.6 RT-PCR检测各组大鼠肾脏tTG mRNA的表达水平

引物序列GAPDH:上游:5'-ACCACAGTCCATGC-CATCAC-3',下游:5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3',扩增片段长度为452 bp;tTG:上游:5'-GGCAATGACTTTGACGTGTTTG-3';下游:5'-ATACAGGGAATCAGAAAGTGGGTTC-3',扩增片段长度为396 bp。以GAPDH校正作相对量分析,应用计算机图像分析系统测算tTG/GAPDH灰度比值。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 各组血糖、尿白蛋白比较 与正常对照组比较,DM 组血糖(22.19±2.50 mmol/L)、24 h尿白蛋白排泄量(355.78±20.34 μ g/24 h)明显升高 ,说明动物已出现明显肾脏功能改变。与DM组比较,GBE组大鼠24 h尿蛋白排泄量(301.58±28.63 μ g/24 h)明显减少(P＜0.05),血糖(20.02±4.96 mmol/L)无明显变化。

2.2 PAS染色光镜观察 对照组肾小球、肾小管形态正常,DM组肾小球系膜细胞增生,PAS阳性物质明显增多,GBE组系膜细胞增生较糖尿病组减轻,系膜区PAS阳性物质明显减少(见图1)。

图1 各组大鼠肾脏PAS染色

2.3 Western Blot检测各组大鼠肾脏tTG蛋白表达水平

图2 各组大鼠肾脏tTG蛋白表达

由图2分析肾脏皮质Western Blot的检测结果,tTG在正常组织中表达较少(0.21±0.12),在糖尿病肾脏中表达明显增加(0.47±0.18,P＜0.01),在GBE组中tTG的表达(0.29±0.07)与DM组比较明显降低(P＜0.01)。

2.4 RT-PCR检测各组大鼠肾脏tTG mRNA的表达水平

由图3分析tTG mRNA在DM组大鼠肾脏中的表达(3.01±0.42)与对照组(1.35±1.02)相比显著增加(P＜0.01),GBE组(2.21±1.14)tTG mRNA的表达与DM组相比明显下降(P＜0.05)。

图3 各组大鼠肾脏mRNA表达

3 讨论

以往临床研究发现经银杏叶治疗的DN患者尿白蛋白显著降低,肾脏结构特别是滤过膜病变明显减轻,在基础研究中同样发现银杏叶对糖尿病大鼠肾结构功能具有保护作用。本试验中我们也得到了相同的结果,给予GBE的糖尿病大鼠尿蛋白排泄率明显降低,PAS染色显示ECM(PAS染色阳性物质)较糖尿病组含量减少。

GBE可通过多种机制实现肾脏保护作用,如抗自由基损伤、抑制脂质过氧化的形成,保护细胞膜不受自由基损害,提高抗氧化能活性[3,4]等。本试验仅从ECM积聚角度讨论。ECM积聚是糖尿病肾病最基本的病理变化。合成增加和降解减少都可导致ECM积聚,而降解酶系统(纤溶系统和基质金属蛋白酶系统)被抑制、tTG表达和活性增加均可引起降解减少。侯淑芬等人的研究表明GBE可调节肾脏内基质金属蛋白酶系统中MMP-9、TIMP-1、织纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)以及Ⅳ型胶原mRNA的表达从而减轻肾小球ECM积聚[1.2]。而GBE对糖尿病肾脏tTG的影响此前尚无报导。在我们的实验结果中发现无论是蛋白水平,还是mRNA水平,GBE均能降低糖尿病大鼠tTG的表达,并且与ECM量(PAS阳性物质)趋势相同,表明GBE可通过降低tTG的表达缓解ECM积聚。结合其他研究学者的研究结果,可以推断GBE对ECM积聚多种途径(ECM合成、降解酶系及调节ECM抵抗蛋白降解酶的水解作用)均有影响。

总之,我们此次研究结果表明糖尿病状态下,tTG活性下降是GBE肾脏保护作用的机制之一。

[1]侯淑芬,张海松,刘占全,等.银杏黄酮苷对糖尿病大鼠肾组织病理变化的影响[J].中国误诊学杂志,2005,5(6):1012.

[2]陈三妹,李 红,王 芳,等.银杏叶提取物对2型糖尿病大鼠肾脏结构和功能的影响[J].中国病理生理杂志,2006,22(8):1654.

[3]廖 璞,王淑琴,廖雪松,等.银杏叶提取物对糖尿病大鼠肾脏保护作用的实验研究[J].中国药房,2000,11(3):114.

[4]Coskun O,Ar mutcu F,Kanter M,et al.Protection of endotoxin-induced oxidative renal tissue damage of rats by vitamin E or/and EGb 761 treatment[J].J Appl Toxicol,2005,25(1):8.