载脂蛋白E对蛛网膜下腔出血后小鼠皮质神经细胞凋亡的影响

田艳霞,徐爱军,刘 桦,卢鹤翔,李 冉,高俊玲

(河北联合大学基础医学院,河北唐山063000)

载脂蛋白E(Apolipoprotein,apoE)在中枢神经系统不但在脂质代谢中起到重要作用,而且,在抗炎、抗兴奋毒性等方面也有作用[1-3],临床资料显示,蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)病人的脑积液中apoE水平降低表明apoE可能与SAH的发病及其愈后有关。apoE全蛋白分子量大,不能通过血脑屏障,影响了外源性的治疗性应用。近来研究合成了来自apoE受体结合区的拟apoE 12肽,分子量为1410D。拟apoE对实验性SAH有治疗作用[4],但其作用机制尚有待探讨。本试验选用外源性的拟apoE1410肽段作为SAH后的干预因素,观察在SAH后apoE对额叶皮质神经细胞凋亡的影响及其可能的作用机制,以期为临床治疗SAH提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性ICR小鼠210只,体重30-35 g,北京维通利华公司提供。小鼠随机分成:①对照组;②SAH组;③apoE治疗组。每组又分别划分为伤后10 min、30min 、1h 、3h 、24h 、48h 、72h 7个时相组。

1.2 主要仪器和试剂 Cty-c兔抗鼠多克隆抗体(武汉博士德公司);Caspase-3兔抗鼠多克隆抗体(武汉博士德公司);山羊SABC法检测试剂盒(武汉博士德公司);DAB显色试剂盒(武汉博士德公司);TUNEL试剂盒(Roche公司);拟apoE1410(美国北卡州立大学)。

1.3 方法

1.3.1 动物给药方法 apoE治疗组以0.6 mg/kg,术前30分钟开始第一次,每12小时一次,共用三天,其它两组只注射生理盐水。

1.3.2 小鼠SAH模型的建立 按照Bederson[5]等方法加以修改,采用非开颅血管内穿刺法制备小鼠SAH模型,自右侧颈外动脉插入经酒精处理的玻璃纤维至大脑中与大脑前交叉处的Villis环前部,刺破血管造成SAH。

1.3.3 免疫组织化学 按试剂盒说明进行,一抗(稀释度为1∶100)4℃下孵育24 h,用相同稀释比的PBS替代一抗作阴性对照,DAB溶液显色。镜下观察阳性细胞胞浆呈棕黄色。阳性细胞免疫反应性强弱用Motic Med 6.0数码医学图像分析系统分析其平均光密度值(OD)的大小来表示。

1.3.4 原位细胞DNA断裂检测(TUNEL法) 标本制备步骤同免疫组化。TUNEL标记反应混合液(阴性对照只加等量核苷酸反应液不含酶,其余均相同)37℃孵育1 h,POD-转化液37℃孵育30 min,DAB显色剂避光显色。镜下观察,核呈蓝色的为阳性细胞。TUNEL阳性细胞数取其目镜网格测微尺200倍光镜视野下随机计数10个小鼠皮质阳性细胞数(个/高倍视野)作为分析对象进行比较。

2 结果

2.1 Ctyc及Caspase-3的蛋白表达 Ctyc免疫阳性反应呈棕黄色沉淀,定位于胞浆。对照组小鼠大脑额叶皮质偶见Cytc免疫阳性细胞。与对照组相比出血组Ctyc于SAH1小时略有表达、3小时明显升高,24小时大量表达,48 h后逐渐下降,与出血组比较apoE治疗组免疫阳性反应在各时相点均降低,以24 h、48 h、72 h差异显著(P＜0.05)。见表1。

Caspase-3阳性细胞胞浆着棕黄色。对照组小鼠大脑额叶皮质Caspase-3免疫反应偶见表达。与对照组相比,SAH组3小时偶见Caspase-3免疫阳性反应;24 h明显升高,48 h大量表达,72小时逐渐下降。与出血组比较,apoE治疗组免疫阳性反应在各时相点均降低,以 24 h、48 h、72 h差异显著(P＜0.05)。见表2。

表1 各组 Cytc免疫活性比较(±s,n=5)

表1 各组 Cytc免疫活性比较(±s,n=5)

注:与对照组相比 ▲P＜0.05,与出血组相比 *P＜0.05

时相 对照组 出血组 治疗组10 min 2.37±0.35 2.52±0.53 2.34±0.42 30 min 2.46±0.86 2.91±1.35 2.75±1.32 1 h 3.95±1.76 4.56±1.11▲ 3.18±1.01▲3 h 3.98±2.32 6.57±2.35▲ 4.57±2.92▲*24 h 4.74±2.48 15.74±2.05▲ 12.32±2.09▲*48 h 3.42±1.32 11.83±1.76▲ 8.24±1.05▲*72 h 2.98±1.19 9.37±1.11▲ 5.83±1.15▲*

表2 各组 Caspase-3免疫活性比较(±s,n=5)

表2 各组 Caspase-3免疫活性比较(±s,n=5)

注:与对照组相比▲P＜0.05,与出血组相比 *P＜0.05

时相 对照组 出血组 治疗组10 min 1.41±0.15 1.43±0.11 1.44±0.12 30 min 1.43±0.56 1.53±0.45 1.55±0.32 1 h 1.41±0.76 1.56±0.71 1.58±0.61 3 h 1.51±0.42 3.17±0.75▲ 3.09±0.12▲24 h 1.94±0.98 10.18±1.05▲ 8.32±0.09▲*48 h 2.30±0.32 14.83±1.76▲ 10.24±0.05▲*72 h 1.56±0.89 11.37±2.11▲ 7.43±0.15▲*

2.2 原位细胞凋亡检测结果 对照组小鼠大脑额叶皮质TUNEL阳性细胞偶见。SAH组细胞凋亡数明显增多,72 h达高峰。与对照组相比,SAH组的细胞凋亡数显著增多;apoE治疗组在各时相点凋亡细胞数目不同程度减少,以 24 h、48 h、72 h差异显著(P＜0.05)。见表3。

表3 皮质 TUNEL阳性细胞数量比较(±s,n=5)

表3 皮质 TUNEL阳性细胞数量比较(±s,n=5)

注:与对照组相比▲P＜0.05,与出血组相比 *P＜0.05

时相 对照组 出血组 治疗组10 min 1.37±0.35 1.52±0.53 1.34±0.42 30 min 1.46±0.86 1.91±0.35 1.75±1.32 1 h 1.95±1.76 1.56±1.11 1.48±1.01 3 h 1.98±2.32 3.57±1.35▲ 3.57±0.92▲24 h 2.74±2.48 25.74±2.05▲ 17.32±2.09▲*48 h 3.42±1.32 31.83±1.76▲ 28.24±1.05▲*72 h 3.98±1.19 42.37±1.11▲ 35.83±1.15▲*

2.3 相关性分析 Cytc与TUNEL阳性细胞数呈直线正相关(r=0.817,P＜0.01)、Caspase-3与 TUNEL阳性细胞数呈直线正相关(r=0.921,P＜0.01)、Cytc与 Caspase-3呈直线正相关(r=0.525,P＜0.01)。

3 讨论

SAH是由于各种原因使血液进入颅腔或椎管内的蛛网膜下腔所引起的综合征,分原发性和继发性两种。前者主要缘于血管压力过高出血量大引发严重并发症,如脑血管痉挛、颅内高压、脑水肿等,后者的损伤机制比较复杂,涉及多种内源性损伤因子(如谷氨酸)的释放,最终引起神经细胞死亡,导致神经功能障碍。最近研究发现[6],SAH后的神经元缺损也可以由细胞凋亡引起,其凋亡现象已在人和动物实验中所证明[7、8]。本实验中TUNEL阳性细胞于出血后24小时显著表达、48小时明显升高、72小时达高峰。可见,SAH时神经细胞死亡可能通过神经元凋亡途径引起。

细胞色素C(Cytochrome,Cytc)是线粒体呼吸链必须的一类色素蛋白,除参与细胞呼吸活动外,在激活和诱导细胞凋亡方面具有重要意义。在神经元凋亡过程中,Cytc通过线粒体外膜释放,在ATP/dATP的参与下,在胞质中与Apaf-1结合形成寡聚体,A-paf-1通过氨基酸与Caspase-9前体的功能前区相互作用凋亡信号刺激使其从线粒体释放至细胞液,之后激活半胱氨酸蛋白酶Caspase-3启动凋亡级联反应[9]。大量实验证实,凋亡的发生似乎是蛋白酶级联切割过程,Caspase-3在这一过程中处于核心位置,被称为死亡蛋白酶,不同的蛋白酶切割Caspase-3促其激活,活化的Caspase-3又切割不同的底物,形成蛋白酶级联切割放大机制,构成凋亡的下游事件,最终导致细胞产生凋亡形态学和生化特征。研究发现将Cytc注入不同类型的细胞,发现其可诱导细胞凋亡[10],抑制Cytc的释放能减轻脑损伤[11]。Clark等[12]在控制性皮质冲击伤模型中也证实了Caspase-3的活化参与了,急性脑损伤后脑组织的丢失,并观察到Caspase-3在24小时达到高峰,应用Caspase-3抑制剂后凋亡减轻。Kuawabara等[13]在椎动脉穿刺模型中发现,出血后早期(4小时)即可检测到Caspase-3,并且持续48小时。本实验中SAH3 h即可以检测到Cytc的增加,24 h达高峰 ,48 h后下降,并且Cytc与TUNEL相关分析呈高度正相关,证实在此模型中Cytc的产生可能参与SAH后皮质神经细胞凋亡。本实验中,出血后24小时,皮质神经元中Caspase-3的表达呈逐渐增多趋势,于48小时达高峰,在顶叶及相邻的额叶、枕叶、颞叶皮质均可见Caspase-3大量表达,与假手术组比较差异显著(P＜0.01)。此外,Caspase-3蛋白的分布与表达其时相性及空间分布与其相邻切片所标记的TUNEL阳性细胞分布大致符合。Cyt-c与Caspase-3呈正相关。以上结果表明SAH后可能通过线粒体释放Cytc激活Caspase-3途径,导致神经细胞发生凋亡。

apoE是正常人血浆脂蛋白中重要的载脂蛋白成分,主要功能为运输并介导某些脂蛋白与相应的受体。近年来apoE在中枢神经系统疾病中的作用引起了广泛关注。内源性apoE或脑室内apoE全蛋白通过下调中枢神经系统炎症反应、减轻氧化应激等作用发挥神经保护作用[14]。研究证实SAH后给予外源性apoE明显改善了脑缺血和SAH的预后[15],但具体机制尚不明确。本实验结果表明apoE在明显降低凋亡数量的同时,对Cytc及Caspase-3其蛋白表达量也相应减少,且TUNEL阳性细胞数与Cytc、Cytc与 Caspase-3、Caspase-3 与 TUNEL阳性细胞数均呈正相关,这也提示了apoE有明显的脑保护作用,而且其机制可能是通过减低Cytc的释放减少Caspase-3途径的凋亡而发挥其脑保护作用。

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