头针诱导神经干细胞的增殖分化

周 利 张晓艳 张红星 邹 燃 刘银妮 王 琼

缺血性脑损伤可以触发脑内分子和细胞修复机制,诱发神经干细胞的增殖分化,引起成年脑神经元再生。新生的神经元还可以迁移到病灶区代替一部分死亡的神经元而发挥一定的功能[1]。通过适当的外部干预措施放大这种神经再生就有可能促进脑损伤后的自我修复。本实验采用线栓法制作大鼠大脑中动脉闭塞模型,通过观察DG区BrdU阳性细胞和BrdU/NeuN双标阳性细胞的表达,验证头针能诱导内源性神经干细胞的增殖和分化,并减少其随时间增殖而衰减。从而借此探讨头针治疗脑缺血的理论依据,为临床治疗脑缺血奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

健康wistar雌性大鼠(SPF级)100只(考虑实验中有死亡及剔除的大鼠),体重为(200±20)g,由湖北省实验动物中心提供(SCXK(鄂)2004-0007)。甲醛溶液,水合氯醛(上海试剂一厂),cy3羊抗兔IgG和FITC羊抗鼠IgG购自三鹰生物科技有限公司,hoechst33258和防淬灭剂封片购自碧云天生物技术研究所,5-溴脱氧尿核苷(BrdU)液购自美国sigm a公司,BrdU单克隆抗体、神经元核性蛋白(NeuN)购自美国santa cruz公司;LH 202H型韩氏穴位神经刺激仪(北京华威有限公司生产)。

1.2 动物模型制备及鉴定

1.2.1 动物模型制备 参照Longa等报道的线栓法[2],并加以改进;以10%水合氯醛(30 m g/kg体重)腹腔麻醉后,在大鼠颈部正中切口暴露右侧颈总动脉(CCA),分离出颈内动脉(ICA),颈外动脉(ECA);以动脉夹阻断CCA血流,再在ECA残端剪0.2mm的小口,插入直径约0.22mm、长为 60 mm的尼龙线;轻推尼龙线端经CCA分叉部沿ICA入颅,至大脑中动脉(MCA),遇阻即止,尼龙线插入深度约(18±0.5)mm;结扎ECA残端口,缝皮;缺血1 h后轻轻向外拉尼龙线,至有阻力感时提示尼龙线头部已离开ICA而位于ECA残端,将体表外的尼龙线剪断,恢复大脑中动脉的血供,实现再灌注;假手术组则不插线栓,不做再灌注;缝合切口后大鼠保温喂养,并观察造模大鼠生命指征。

1.2.2 动物模型鉴定 观察造模大鼠清醒后行为学改变,按Zea Longa五级评分标准[2]进行神经功能缺损评分。0分为无神经缺损症状;1分为不能伸展对侧前爪;2分为行走时向偏瘫侧转圈;3分为向偏瘫侧倾倒;4分为不能自发行走,意识丧失。本实验剔除其中0分及4分者。

1.3 动物分组

在实验过程中造模后的大鼠死亡18只,剔除12只。将成功模型鼠随机分为2组：模型组和治疗组(均设7、14、28 d时间点,各时间点n=10)。假手术组10只(设7、14、28 d时间点,各时间点 n分别为 4、3、3 只)。

1.4 治疗

1.4.1 所有模型组和假手术组大鼠造模后常规饲养,不予任何治疗。

1.4.2 头针组造模后即可行头针治疗。头针选穴依据《头针国际标准化方案》,选取顶颞后斜线,顶颞前斜线。大鼠穴位定位根据华氏等介绍的大鼠穴位图谱[3],模拟人体经穴定位。30号1寸“瑞琪尔”(NATURA L)牌一次性无菌针灸针,进针深度约0.5 cm,进针后接韩氏治疗仪,疏密波,频率2 H z/100 Hz,强度2m A,每次20m in,每天1次。

1.5 BrdU标记法

将BrdU用生理盐水配制成5mg/m l的溶液。各组大鼠于处死前1 d腹腔注射BrdU(50mg/kg),每2 h注射1次,共注射4次,最后1次注射结束24 h后处死大鼠。

1.6 标本的采集与处理

标本采集：各组大鼠于再灌注后各时间点将大鼠用100 g/L水合氯醛腹腔注射(300mg/kg)麻醉,用多聚甲醛经心脏灌注固定,取脑后固定24 h,待用。

免疫荧光检测：选择含海马齿状回的脑组织连续6μm冠状切片,(1)常规脱蜡至水;(2)切片入3%H2 O2-甲醇室温下孵育30 min;(3)微波修复;(4)10%羊血清湿盒内37℃下孵育30 min;(5)分别用一抗为兔抗的BrdU(1∶100)和一抗为鼠抗的NeuN(1∶100)混合液滴加于标本上进行孵育,湿盒内4℃过夜;(6)cy3羊抗兔IgG和FITC羊抗鼠IgG混合液,湿盒内37℃孵育45 min;(7)hoechst 33258染核。上述各步骤除羊血清孵育后不洗外,其他各步骤均用0.01 M PBS震荡漂洗5 min×3次;(8)防淬灭剂封片;(9)每只大鼠随机选取海马3张切片,高倍物镜下取缺血侧海马6个非重叠视野,计数其中BrdU、BrdU/NeuN阳性细胞数。

1.7 统计学处理

2 结 果

2.1 头针对神经功能缺损评分的影响 假手术组无行为学改变,故与模型组、头针组在各时相上的NSS比较均有显著性意义(P＜0.01);头针组与模型组在各时相上的NSS比较,28 d组有显著性差异(P＜0.05)(表1)。

2.2 BrdU单标 各组大鼠的DG均可见BrdU阳性细胞,在缺血再灌注后DG区BrdU阳性细胞数增加更明显,7 d达到峰值,14 d后逐渐减少,28 d时明显下降。模型组、头针组各时间点阳性细胞数较假手术组明显增加,差异有显著性(P＜0.01);头针组的BrdU阳性细胞各时间点较模型组亦明显增加,差异有显著性(P＜0.01)(表2)。2.3 BrdU/NeuN阳性细胞数 假手术组中海马仅存在少量BrdU/NeuN阳性细胞,而缺血再灌注后则可见BrdU/NeuN阳性细胞数有显著变化(P＜0.01),海马的阳性细胞开始增加,28d达到峰值。头针组阳性细胞数相对于模型组也有显著差异(14、28d组 P＜0.01)(表3)(图1～9)。

表1 各组大鼠神经功能缺损评分比较(±s)

表1 各组大鼠神经功能缺损评分比较(±s)

注：与相同时间点的假手术组比较,*P＜0.01;与相同时间点的模型组比较,▲P＜0.05

组别 NSS 7d 14d 28d假手术组 - - -模型组 2.80±0.42* 2.70±0.48* 2.60±0.52*头针组 2.60±0.70* 2.20±0.79* 1.80±0.79*▲

表2 各组BrdU阳性细胞数比较(±s)

表2 各组BrdU阳性细胞数比较(±s)

注：与相同时间点的假手术组比较,*P＜0.01;与相同时间点的模型组比较,▲P＜0.01

组别 BrdU阳性细胞数7d 14d 28d假手术组 40.00±2.58 39.33±3.06 40.00±2.00模型组 105.30±4.11* 88.50±4.25* 76.30±5.17*头针组 136.70±4.06*▲ 94.60±3.95*▲ 85.90±4.18*▲

图1 假手术7d组Brdu/NeuN阳性细胞表达水平(×400倍)

图2 模型7d组Brdu/NeuN阳性细胞表达水平(×400倍)

图3 头针7d组Brdu/NeuN阳性细胞表达水平(×400倍)

图4 假手术14d组Brdu/NeuN阳性细胞表达水平(×400倍)

图5 模型14d组Brdu/NeuN阳性细胞表达水平(×400倍)

图6 头针14d组Brdu/NeuN阳性细胞表达水平(×400倍)

图7 假手术28d组Brdu/NeuN阳性细胞表达水平(×400倍)

图8 模型28d组Brdu/NeuN阳性细胞表达水平(×400倍)

图9 头针28d组Brdu/NeuN阳性细胞表达水平(×400倍)

表3 各组大鼠BrdU/NeuN阳性细胞数比较(±s)

表3 各组大鼠BrdU/NeuN阳性细胞数比较(±s)

注：与相同时间点的假手术组比较,*P＜0.01;与相同时间点的模型组比较,▲＜0.01

组别 BrdU/NeuN阳性细胞数7d 14d 28d假手术组 2.75±1.26 2.33±0.56 2.67±0.58模型组 7.00±2.11* 13.70±2.98* 22.80±2.62*头针组 7.80±3.01* 19.20±3.05*▲ 32.70±3.33*▲

3 讨 论

神经干细胞是一组具有自我更新和多分化潜能的细胞。成年哺乳动物中枢神经系统内多个部位存在神经干细胞,其中侧脑室壁的脑室下区(subventricularzone,SVZ)和DG是神经干细胞的主要分布区[4]。这些有分化潜能的干细胞通常处于“静止”状态只有在某些特殊因素作用下或者受到损伤刺激时才被激活,重新进入细胞增殖周期,并进一步分化为特定功能的神经细胞[5]。脑缺血可激活NSCs的增殖分化,为脑缺血的自我修复带来了希望。但是仅靠脑缺血调动内源性NSCs是远远不够的,一方面NSCs的数量不足;另一方面调节增生、迁移、分化、神经元修复和突触形成的因子也不足[6]。头针在临床上治疗缺血性脑卒中已经取得了明显疗效,且头针可明显缩小脑梗死的面积,减少坏死灶周围的水肿和炎症反应[7],能使多种神经营养因子(如脑源性神经营养因子、碱性成纤维生长因子等)的分泌增多,而脑缺血后神经营养因子的表达上调又是神经干细胞增殖、迁移、分化、网络化的重要因素[8]。因此我们推测头针治疗缺血性脑卒中可能促进了内源性NSC参与脑缺血的修复。

BrdU是一种胸腺嘧啶脱氧核苷类似物,在细胞增殖周期的S期嵌入细胞核的DNA,因而BrdU阳性细胞被看作具有增殖活性的细胞,是自体神经干细胞增殖的标记物[9]。Iw ai等利用沙鼠全脑缺血/再灌注模型发现,模型动物5 d后海马的BrdU阳性细胞开始增加,10 d左右达到高峰,20 d时降至对照组水平[10]。李常新等发现电针治疗促使梗死灶边缘、对侧镜区BrdU阳性细胞增多,随着治疗时间增加,细胞增多更明显,提示电针治疗可促使神经前体NSC增殖及迁移[11]。本研究结果显示,正常成年大鼠脑组织中只有少量 BrdU阳性细胞存在,脑缺血再灌注后BrdU阳性细胞表达增强,7 d达到峰值,然后开始递减,经头针刺激后BrdU阳性细胞表达明显高于模型组,故可以认为头针治疗能够促进NSCs的增殖。

神经元核心抗原(neuron-specific p rotein/neural nuclei,NeuN)是一种可溶的核蛋白,是神经元的标记蛋白,其免疫反应性在神经元分化成熟后即开始出现[12],因此BrdU/NeuN阳性细胞是向神经元方向分化的神经干细胞。本研究免疫荧光结果显示BrdU/NeuN阳性细胞数在再灌注后14 d明显增加,28 d后达到高峰,这说明脑缺血后增殖的神经干细胞14 d后开始分化为神经元,头针组28 d BrdU/NeuN阳性细胞数明显高于模型组,提示头针对增殖后的NSCs分化为神经元也起到促进作用。

1 李 欧,朱心红,高天明.成年大鼠全脑缺血性脑损伤后神经前体细胞的增殖周期变化.南方医科大学学报,2006,26(5)：564-566,569.

2 Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversiblem iddle cerebralartery occlusion without craniectom y in rats.Stroke,1989,20(1)：84-91.

3 华兴邦.大鼠穴位图谱的研制.实验动物与动物实验,1991,(1)：1-5.

4 Gage H F.Mammalian neural stem cells.Science,2000,287(5457)：1433-1438.

5 Bjornson CR,R ietzeR L,Reynolds BA,et al.Turing b rain into blood：A ematopoietic fate adopted by adult neu ral stem cells in vivo.Science,1999,283(5401)：534-537.

6 周盛年,孙 弦.神经干细胞与脑缺血治疗的相关研究.中国卒中杂志,2008,3(5)：381-384.

7 W ada K,Ito M,M iyazawa T.Repeated hyperbaricoxygen induces ischemic tolerance in gerbil hippocampus.Brain Res,1996,740(1-2)：15-20.

8 唐 强,徐志华,白 晶.电针对大鼠脑梗死后内源性神经干细胞增殖迁移的影响.针灸临床杂志,2008,24(8)：49-51.

9 CiaroniS,Cecchini T,FerriP,et al.Impairmen t of neuralp recu rsor proliferation increases survivalof cell progeny in the adult rat dentate gyrus.M ech Ageig Dev,2002,123(10)：1341-1352.

10 IwaiM,H ayashi T,Zhang M R,et al.Induction ofhighly polysialylated neu ral cell adhesion molecu le(PSA-NCAM)in post ischem ia gerbil hippocampus mainly dissociated w ith neu ral stem cell proliferation.Brain Res,2001,902(2)：288-293.

11 李常新,黄如训,陈立云,等.电针对脑梗死大鼠神经前体细胞增殖水平的影响.中华物理医学与康复杂志,2004,12(26)：725-728.

13胡晓松.NeuN及其在局灶性脑缺血再灌注研究中的应用.华西医学,2004,19(2)：329-330.