短小芽孢杆菌木聚糖酶的同源建模及分子动力学模拟

葛慧华,李红春,张光亚

(华侨大学化工学院,福建泉州 362021)

短小芽孢杆菌木聚糖酶的同源建模及分子动力学模拟

葛慧华,李红春,张光亚

(华侨大学化工学院,福建泉州 362021)

克隆并测序来源于短小芽孢杆菌的木聚糖酶基因,测定其编码产物的理化性质并鉴定其表达产物为常温酶蛋白.利用同源建模构建出具有较高精度的三级结构模型,并进行优化和评估.利用分子动力学模拟木聚糖酶基因对热不稳定的分子机制,了解影响该酶热稳定性的因素,寻找对热不稳定性的区域.通过与嗜热木聚糖酶比较发现,两者在3个区域的分子动力学行为存在较明显的差异.

木聚糖酶;短小芽孢杆菌;同源建模;热稳定性;分子动力学模拟

木聚糖酶(EC3.2.1.8)是一种重要工业用酶,属于F/10和 G/11家族.由于 G/11家族的木聚糖酶分子更小,且其结构较为简单,更适合作为理论研究分子的模型[1],用于极端条件下木聚糖酶催化模式系统及蛋白质分子折叠机理等的研究.分子动力学模拟能提供在不同温度下,极短时间内蛋白分子构象的变化,是研究蛋白质去折叠或者变性机理的重要手段,它有着实验无法比拟的优势[2-3].然而,国内大多数分子动力学研究主要集中于小分子物质,而对生物大分子的研究相对较少[2,4-5].本文获取了来源于短小芽孢杆菌木聚糖酶基因,测定其编码产物的理化性质,构建出具有较高精度的三级结构模型,并进行了分子动力学模拟.

1 材料与方法

1.1 材料

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus,中国普通微生物菌种保藏管理中心);E.coliDH5α(中国科学院遗传与发育生物学研究所吴乃虎教授惠赠);质粒pMD18-T,DNA回收试剂盒Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit Ver.2.0,限制性内切酶及其缓冲液(大连TaKaRa公司).

1.2 方法

1.2.1 引物 参考其他来源于芽孢杆菌属的木聚糖酶序列,使用DNA club辅助设计引物,并在5’端分别加上Bam HⅠ和XhoⅠ的限制性内切酶位点.设计的上游引物L1:5/GCGCGGA TCC A TGAA TTTGA GAAAA TTAAG3/;下游引物L 2:5/GA TGCTCGA T GTTGCCAA TAAACA GCTGA TTG3/.L 1和L 2中的划线部分分别是Bam HⅠ和XhoⅠ的酶切位点.引物委托北京奥科公司合成,基因测序由北京华诺公司完成.

1.2.2 同源建模及模型评估 将返回的测序结果翻译成蛋白质,并在SW ISS-MODEL上完成同源建模[6];利用M etaMQA P[7]对模型进行评估及优化.

1.2.3 分子动力学模拟 分子动力学模拟软件为NAMD,视图、建模和数据处理软件为其辅助软件VMD[8].使用的力场为经验力场CHARMM力场.其基本过程分为如下几步:(1)能量最小化;(2)溶解蛋白;(3)加入离子;(4)体系升温(此处温度为400 K);(5)最终的分子动力学模拟.

2 木聚糖酶的基因及其编码产物的理化性质

以短小芽孢杆菌Bacillus pum illus基因组DNA为模板,利用 P1和 P2为引物聚合酶链反应(PCR),扩增得到编码木聚糖酶的xynA基因.PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳分析,结果如图1所示.由图1可见,扩增片段大小约为700 bp,与实际大小的680 bp吻合.

根据Taq DNA聚合酶在PCR产物的3’末端加1个“A”碱基的特性,将PCR产物切胶回收后,与 T载体pMD18-T连接,连接产物转化至E.coliDH 5α.利用氨苄青霉素进行初步筛选,挑取5～6个转化子扩培,抽提质粒,进行单、双酶切鉴定.

重组质粒pMD-xynA用BamHⅠ单酶切,得到一条大小约3.4 kp的片段,如图2(a)所示.这是空载体与目的基因大小之和.用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切,得到两条大小分别为2.7 kp和700 bp的片段,如图2(b)所示.它们分别是空载体和目的基因的大小.这表明目的基因已成功插入表达载体pMD 18-T中.测序结果表明,其开放阅读框(ORF)的长度为687 bp.经BLAST比对证实,该基因为编码木聚糖酶基因,在NCB I的登录号为EF090270.

该酶经表达并测定,其最适温度为50℃[9].进一步测定酶在不同温度下保温30 min后残留的酶活力,结果如图3所示.由图3可知,在70℃时保温30 min残留的酶活力仅有25%左右,而在80℃以上则几乎完全失活,这说明其高温耐受性较差.与大多数来源于芽孢杆菌的木聚糖酶相比[10],其理化性质较为接近.从其最适温度及热稳定性可以判断,该木聚糖酶属于常温酶蛋白.

图1 xynA基因的PCR扩增Fig.1 Electropho resis of PCR products of xynA

图2 重组克隆载体pMD-xynA 的限制酶酶切鉴定Fig.2 Identification of recombinant cloning vector pMD-xynA digested by restriction enzyme

图3 木聚糖酶的热稳定性Fig.3 Thermostability of xylanase

3 木聚糖酶的同源建模

木聚糖酶基因(编号:EF090270)编码的木聚糖酶蛋白序列总长度为228个氨基酸.通过在PDB数据库进行BLAST比对,发现它与编号为1IGO的(来源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis)木聚糖酶同一性最高,可达84.58%,以其为模板进行三级机构的同源建模.

由于所获得的木聚糖酶存在一个长度为27个氨基酸的信号肽,因此在同源建模过程中去掉了这一段序列.为了保证后续分子动力学研究的准确性,需要充分评估建模获得的三级结构的可靠性.

4 木聚糖酶的结构评估及优化

利用Sw iss-model进行同源建模后,使用了目前较好的评估方法M etaMQAP对其进行评估和结构优化.评估结果表明,该模型准确率得分值为84.701,均方根误差为1.299,说明模型可靠性很高.

针对每个氨基酸残基中原子-原子相互作用,二级结构类型、水分子可及性,以及与其他氨基酸残基的相互作用等因素得到的分值(P)和MetaMQAP的全局得分值(M),如图4所示.由图4可见,大多数氨基酸残基都位于得分较高的区域.

经优化后的木聚糖酶三级结构,如图5(a)所示;然后,在VADAR上构建其结构的拉氏图,如图5 (b)所示.由图5(b)可见,绝大多数氨基酸残基都落在允许的区域,它对应于可接受的侧链环境.综上可知,优化后的三级结构是可靠的.

图4 木聚糖酶三级结构模型的评估Fig.4 Evaluation of the 3D structure of xylanase

图5 木聚糖酶三级结构及其拉氏图Fig.5 3D structure of xylanase and its Ramachandran plot

5 木聚糖酶分子动力学模拟

为了对比并了解该常温木聚糖酶的分子动力学行为,选取了编号为1F5J(来源于嗜热菌D ictyog lom us thermophilum)的木聚糖酶.该酶长度为199个氨基酸,和获取木聚糖酶模型(201个氨基酸)长度相近,其最适温度为75℃,具有较好的热稳定性,为嗜热酶蛋白[11].在400 K温度下,两种木聚糖酶各残基RM SD(差异均方根)值[2]的分布,如图6所示.由图6可知,在整个模拟的过程中,各位点RM SD的变化趋势类似,这可能和它们相似的结构有关.

图6 木聚糖酶各残基的RMSD值Fig.6 RMSD values of the xylanase residues

然而,嗜热木聚糖酶1F5J在整个模拟过程中RM SD普遍高于常温木聚糖酶,说明其嗜热木聚糖酶分子的柔性更强,尤其在其N端,第30位至42位、第122位到134位之间.研究表明,N端对于木聚糖酶的热稳定性非常重要.一般情况下,常温木聚糖酶N端较短,且在其N端有一段不规则loop结构;而嗜热蛋白则往往是一段β-折叠.已有实验证实,将黑曲霉中木聚糖酶A的N端用嗜热菌Thermom onospora fusca中木聚糖酶的N端替换后,其热稳定性和催化活性均有提高[12].

从所获得木聚糖酶xynA的三级结构可以看出,在其N端也有一段长约10个左右的氨基酸形成了一段loop结构,连接着两段很短的β-折叠,这印证该酶为常温酶蛋白.中间的30～42位区间主要是β-折叠和loop连接的区域,它们是形成木聚糖酶疏水核(hydrophobic core)的部分;而第122位到134位间则主要是两段短的β-折叠通过loop连接而成,也是一段柔性较强的区域.在159位到168位是该分子中所具有最长的一段(也是唯一一段)α-螺旋区域,这是一段相对刚性的区域.因此,在整个模拟过程中变化不大,与之前报道吻合[13].在第100位和第180位附近的区域,两种酶的差异较小.经比较发现,这两个区域是木聚糖酶活性位点所在的区域.有趣的是,该酶活性位点都分布在这些区域.

6 结束语

研究木聚糖酶的分子动力学特性,能提供另一种研究该酶热稳定性的机制,同时也能寻找出较早发生热变性的区域(或者是对热不稳定性的区域).这就是后续突变需要改造的区域.可见,分子动力学模拟可为酶的定向改造提供有价值信息.

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(责任编辑:黄晓楠英文审校:刘源岗)

Homology Modeling and Molecular Dynam ic Simulation of Xylanase from Bacillus pum ilus

GE Hui-hua,L IHong-chun,ZHANG Guang-ya
(College of Chemical Engineering,Huaqiao University,Quanzhou 362021,China)

The gene of xylanase fromBacillus pumiluswas cloned and sequenced.This xylanase was identified as a me-sophilic enzyme.The tertiary structure of the xylanase originated from homology modeling was evaluated and op timized. Based on the optimal structure,molecular dynamic simulation of the mesophilic xylanase and a thermphilic one was performed using NAMD.The results showed that there were three regions which showed differences between the mesophilic and thermophilic xylanase.The molecular dynamic analysis suggested regions in the protein structure which were mo re unstable and thus potential targets for mutation to imp rove its thermostability.

xylanase;Bacillus pum ilus;homology modeling;thermostability;molecular dynamic simulation

Q 71;Q 55

A

1000-5013(2011)03-0296-04

2010-01-19

张光亚(1975-),男,副教授,主要从事生物信息与生物化工的研究.E-mail:zhgyghh@hqu.edu.cn.

福建省自然科学基金资助项目(2009J01030);华侨大学科研基金资助项目(07HZR20)