抑癌基因PML在宫颈病变组织中的突变探讨

何志晖,李清秀,王 莉,谭佩婵

(广州医学院第一附属医院妇产科,广东广州,510120)

子宫颈癌的发病率占女性生殖道恶性肿瘤的首位。近代我国每年新发宫颈癌病例约为13.5万,近几年全球范围宫颈癌的发病率有明显升高,严重威胁妇女的健康和生命,全世界每年约有20万妇女死于该病[1]。因此,早期诊断宫颈癌、预防宫颈癌的发生,预测宫颈癌的侵袭与转移能力,进而提高妇女的生活质量,是当今许多相关学科所面临的重要课题。宫颈癌的病因至今尚未完全明确,研究显示人乳头瘤病毒(HPV)感染与宫颈癌关系密切[2-3],但单纯HPV感染不足以引起癌变。宫颈癌的发生受宿主免疫功能、遗传易感性、营养状况及行为等因素的影响,细胞癌变过程中有多种癌基因及抑癌基因的参与。细胞内遗传因素的改变对宫颈癌的发生起着非常重要的作用[4]。因此,确定宫颈癌相关基因,从分子水平上了解细胞癌变机制,为宫颈癌的早期诊断、预防、易感性预测及治疗提供分子标记具有十分重要的意义。随着分子生物学技术的发展,与宫颈癌发生、发展及转移相关的癌基因、抑癌基因相继被分离克隆。

早幼粒细胞性白血病基因(PML)最先在早幼粒细胞性白血病患者中被发现,与早幼粒细胞性白血病关系密切。该基因位于第15号染色体上,它编码一系列生长蛋白,这些蛋白中的一部分具有抑制肿瘤生长和稳定基因组的作用[5]。PML在致癌性转化和DNA损伤时能诱导细胞凋亡和生长抑制,这对抑制肿瘤的生长起着非常重要的作用[6]。PML是一种广谱的肿瘤细胞生长抑制因子。目前对PML与宫颈癌和宫颈上皮内瘤样病变的关系、PML与宫颈癌的细胞分级与临床分期的关系、PML与宫颈癌患者预后的关系尚不太清楚。

本研究的目的是研究宫颈癌和CIN组织中PML基因是否存在突变。

1 资料与方法

1.1 实验材料

随机选取于2009年6月～2011年2月在本院因宫颈病变行手术治疗的病例新鲜组织样本,包括CIN Ⅰ 30例、CIN Ⅱ 30例、CIN Ⅲ 30例、宫颈浸润鳞癌30例、以及因其他疾病切除子宫病理证实为慢性宫颈炎者30例。年龄25～80岁,平均年龄43.85岁。

1.2 实验方法

取新鲜组织标本5克,常规用氛-氯仿法提取基因组DNA。

对所有标本DNA进行9个外显子及内含子-外显子交接区的DHPLC筛查。根据UCSC及文献报道[7]的引物序列共合成11对引物,其中第3和9外显子各含2对引物。引物序列及PCR条件、DHPLC筛查条件等见表1。

表1 PML基因引物序列及DHPLC筛查条件

各个片段的PCR反应体系及条件,有些片段用Fermentas公司的酶扩增效果不好,需用DBI酶(E-1)或Takara公司的酶(E-7)来扩增:

PCR反应体系(Fermentas)见表2。

表2 PCR反应体系

PCR反应体系(DBI)见表3。

表3 PCR反应体系

PCR反应体系(Takara)见表4。

反应条件:94℃预变性3min;94℃变性30s,引物特异退火温度复性45 s,72℃延伸50 s,35次循环;72℃延伸10 min。

扩增结果检测:选择1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳,溴乙啶或其无毒替代品染色,紫外灯下观察扩增效果。

表4 PCR反应体系

DHPLC的操作:变性高效液相色谱WAVE核苷酸片段分析系统2100-B(美国Transgenomic公司)。将PCR产物96℃变性5 min,缓慢冷却至室温,以充分形成异源和同源双链DNA分子混合物。将待分析的PCR样品放入WAVE系统96孔反应板,输入被检测片段的序列,确认进样量。WAVE-Maker软件自动分析出序列的解链曲线,根据预测的熔解温度,通过预实验获得各片段的最适检测温度。依照程序指令,进样器自动吸取8～12 μ L PCR产物,注入DNASep检测柱内。流动相为缓冲液A(0.1 moL/L的TEAA)和缓冲液B(含0.1 moL/L的TEAA及25%的乙腈),在待测样品部分变性和乙腈冲洗梯度线性增加的情况下,缓冲液以0.9 mL/min的流速将结合在检测柱上的DNA分子洗脱下来,在260 nm波长处读取吸光值,经WAVE分析软件处理形成DHPLC峰型图供分析鉴定。

测序:对于DHPLC筛查后出现色谱峰型异常者,PCR扩增产物进行双向DNA测序加以验证,并进行2次独立的PCR产物测序,测序由上海英骏生物技术有限公司完成。应用Chromas和CLustaLx软件将测序结果与数据库中的序列资料进行比对分析。对30例诊断为宫颈浸润鳞癌的患者除了行DHPLC筛查外,还随机选取了10例行全部9个外显子及内含子-外显子交接区的PCR产物测序。

2 结 果

DHPLC 在E-4、E-7、E-9-1和E-9-2的筛查中发现少数样本呈现异常峰型,但对DHPLC色谱峰型异常者进行双向测序并未发现基因突变。随机选取10例宫颈浸润鳞癌患者行PML基因9个外显子及内含子-外显子交接区的PCR产物测序均未发现突变。

3 讨 论

目前国内外已有很多学者对与宫颈癌相关的抑癌基因和癌基因进行了研究。他们证实了与宫颈癌相关的癌基因有 C-erbB-2、c-myc、cfos、bcL,抑癌基因有 p53 、p27、p16、FHIT 、Rb、nm23。1996年Gambacorta等[8]报道 PML蛋白在浸润性上皮性肿瘤中的表达下降。2003年Szendefi等[9]首先报道PML与宫颈癌病程严重程度密切相关,从正常宫颈组织到CINⅠ和CINⅡ,PML的表达量增加;在CINⅢ和宫颈浸润鳞癌中,低分化者 PML的表达量降低。2004年CarmeLa Gurrieri等报道[7]PML在多种肿瘤(结肠腺癌、肺癌、前列腺腺癌、乳腺癌和生殖细胞肿瘤等)组织中表达缺失,并与肿瘤的分级和分期相关;虽然在多种癌组织中PML的表达量减少,但作者发现其表达量的减少由PML基因突变而引起的很少见,虽然PML的mRNA表达有所改变,但其改变与蛋白表达没有相关性。

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[6]SaLomoni P,PandoLfi P P.The roLe of PML in tumor suppression[J].CeLL,2002,108:165.

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[8]Gambacorta M,FLenghi L,FagioLi M,et al.Heterogeneous nucLear expression of the promyeLocyticLeukemia(PM L)protein in normaL and neopLastic human tissues[J].Am J PathoL,1996,149:2023.

[9]Szendefi M,WaLt H,Krasieva T B,et al.Association between promyeLocyte protein and smaLLubiquitin-Like modifier protein and the progression of cervicaL neopLasia[J].Obstet GynecoL,2003,102:1269.