荧光染色发光二极管显微镜检测结核分枝杆菌的效果分析

陈燕梅 钱明 江勇 陈涛 李海成 钟球

目前痰涂片染色镜检常用有2种染色方法：萋－尼染色法 （简称Z－N染色法）和金胺O荧光染色法［1]。前者是使用已有百余年历史的染色技术，因为其操作简单、费用低、速度快，1h可以报告结果而一直延用至今。这种方法在标本量少，工作量不大的情况下是一种不错的筛查结核病检测结核分枝杆菌的方法；但对于标本量多、工作量大、实验人员少的单位，此法就难以满足临床需要，因此寻找一种更快速、灵敏的方法来帮助检测结核分枝杆菌就显得尤为重要。

材料和方法

一、试剂和器材

荧光法染色液（包括金胺O初染液、脱色液、高锰酸钾复染液）和Z－N染色液（包括石碳酸复红液、脱色液、亚甲蓝复染液）均按《痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》［2]进行配制；使用LEICA DM 1000发光二极管全冷光源荧光显微镜及奥林巴斯CH40生物显微镜。

二、检测标本

痰标本来自2010年1月至2010年12月粤西地区2个县结核病门诊就诊的可疑肺结核患者，全部为初诊患者。本实验共收集232例患者的痰标本696份。每位患者收集3份深咯痰标本，分别为清晨痰、夜间痰和即时痰。标本量为3～5ml，每份痰标本涂抹2张玻片，分别进行Z－N染色和金胺O荧光染色。

三、涂片

用竹签挑取痰标本的脓样、血样或干酪样部分约0.05～0.1ml于玻片正面的右侧2／3中央处，并均匀涂抹成1.0cm×2.0cm椭圆形痰膜，厚薄适中。室温下自然干燥。

四、Z－N染色和金胺O荧光染色

均按《中国结核病防治规划痰涂片镜检及质量保证手册》进行初染、脱色、复染。

五、镜检及结果判定

Z－N染色用普通光学显微镜镜检，10倍目镜、100倍油镜观察。在淡蓝色背景下，结核分枝杆菌呈红色，其他细菌和细胞呈蓝色。荧光染色用发光二极管显微镜，10倍目镜、40倍物镜观察痰涂片，在暗视野背景下，结核分枝杆菌呈现橘黄色荧光，呈杆状或短棒状。Z－N镜检结果报告标准为：抗酸杆菌阴性：连续观察300个不同视野，未发现抗酸杆菌；抗酸杆菌阳性（报告抗酸杆菌菌数）：1～8条／300视野；抗酸杆菌阳性（1＋）：3～9条／100视野；抗酸杆菌阳性（2＋）：1～9条／10视野；抗酸杆菌阳性（3＋）：1～9条／每视野；抗酸杆菌阳性（4＋）：≥10条／每视野；报告1＋至少观察300视野，2＋至少观察100个视野，3＋、4＋时至少观察50个视野。LED镜检结果报告标准为：荧光染色抗酸杆菌阴性：0条／50视野；荧光染色抗酸杆菌阳性（报告抗酸杆菌菌数）：1～9条／50视野；荧光染色抗酸杆菌阳性（1＋）：10～49条／50视野；荧光染色抗酸杆菌阳性（2＋）：1～9条／每视野；荧光染色抗酸杆菌阳性（3＋）：10～99条／每视野；荧光染色抗酸杆菌阳性（4＋）：＞100条／每视野；报告2＋至少观察50视野，3＋及以上至少观察20个视野。

六、资料的统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件，率采用配对χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

LED组232例可疑结核病患者的痰标本中检出88例阳性，阳性率为37.9%；Z－N组检出62例阳性，阳性率为26.7%；χ2＝6.66，P＜0.01，差异有统计学意义（表1）。在检测1＋或以下菌量的标本时，LED组镜检组阳性率为14.22%，Z－N组阳性率为6.17%；χ2＝24.59，P＜0.01，差异有统计学意义（表2）。两种染色方法均以干酪痰阳性检出率最高，干酪痰涂阳率＞黏液痰涂阳率＞唾液痰涂阳率，它们的涂片阳性率分别为 78.9%、23.9%、7.5%和81.6%、38.3%、11.9%（表3）。表3结果还显示，LED组：干酪痰与黏液痰比较，χ2＝50.00，P＜0.01；干酪痰与唾液痰比较，χ2＝100.73，P＜0.01；黏液痰与唾液痰比较χ2＝33.16，P＜0.01。Z－N组：干酪痰与黏液痰比较，χ2＝92.7，P＜0.01；干酪痰与唾液痰比较，χ2＝111.52，P＜0.01；黏液痰与唾液痰比较χ2＝17.50，P＜0.01。

表1 Z－N染色和金胺O荧光染色结核分枝杆菌检测结果分析（例）

表2 Z－N染色和金胺O荧光染色结核分枝杆菌检测结果比较

表3 两组不同性状痰标本结核分枝杆菌阳性检测结果

讨 论

LED方法染色镜检时抗酸杆菌在暗视野背景下发出橘黄色荧光，黑色背景与抗酸杆菌对比鲜明，非常明显容易发现，荧光染色读片放大倍数为400倍（40倍物镜，10倍目镜），所观察的视野面积大，故它的灵敏度比Z－N方法普通显微镜镜检高［3－4]；LED 组 与 Z－N 组 在 特 异 度 上 亦 无 差 异［5]。本研究结果显示，LED组检出阳性率为37.9%，Z－N组为26.7%，χ2＝6.66，P＜0.01，两者的阳性检出率差异有统计学意义；两组阳性检出率差异主要体现在结果为1＋及以下的标本，即含菌量少的痰标本上，LED 组为14.2%，Z－N 组6.2%，χ2＝24.59，P＜0.01，差异有统计学意义，而2＋、3＋、4＋的阳性率P值均大于0.05，差异无统计学意义。这表明痰标本含菌量较少时直接涂片LED法镜检较Z－N法具有更高的灵敏度，这样可防止漏诊的出现，对于那些病变活动性轻、排菌量较少的肺结核诊断具有重要意义，及时准确发现这部分具有传染性的肺结核患者对于我国的结核病预防控制、流行病学调查、治疗等有重大意义。

结果同时显示，两种染色方法均以干酪痰阳性检出率最高，干酪痰涂阳率＞黏液痰涂阳率＞唾液痰涂阳率，它们的涂片阳性率分别为78.9%、23.9%、7.5%和81.6%、38.3%、11.9%。血痰是干咳引起的细支气管破裂出血或病灶出血与脓痰或黏液痰混合而成的标本，故根据肉眼判断而将之归为干酪痰或黏液痰。LED组：干酪痰与黏液痰比较，χ2＝50.00，P＜0.01；干酪痰与唾液痰比较，χ2＝100.73，P＜0.01；黏液痰与唾液痰比较，χ2＝33.16，P＜0.01；Z－N 组：干酪痰与黏液痰比较，χ2＝92.70，P＜0.01；干酪痰与唾液痰比较，χ2＝111.52，P＜0.01；黏液痰与唾液痰比较，χ2＝17.50，P＜0.01，差异具有统计学意义。提示为了提高结核患者的发现率和痰检阳性率，无论采用何种的检测方法都应注意收集合格的痰标本，尤其是收集脓性干酪样的痰标本进行检查，痰标本的质量直接影响检验的结果。

荧光染色读片放大倍数为400倍（40倍物镜，10倍目镜），所观察的视野面积大，观察相同面积视野所需时间短，报告阴性结果只需读片50个视野（通常需2min左右）。由于读片时间短，所以可加快痰标本的筛查速度。而Z－N法镜检读片放大倍数为1000倍（100倍物镜，10倍目镜），油镜观察视野范围小，报告阴性结果需读片300视野或需读片5min左右；镜检人员容易出现视觉疲劳。往往容易漏诊掉一些菌含量少的痰液标本，亦往往制约检验人员的工作量。因此LED镜检更适合用于工作量大、标本量多的单位使用，可提高工作效率，及时满足临床早期诊断的需要。

LED法较Z－N法有节约试剂、减少试验成本、简化操作的优势。染色时无需加热，可降低实验人员因加热而吸入有害物质的危险。不需使用镜油和擦镜纸等消耗品，LED法与Z－N法染色1张涂片所需的初染液、脱色液、复染液的用量基本相同，每张涂片需初染液、复染液各约3ml，需脱色液约6ml，购买试剂的费用亦相差不多。而LED法省略了初染色加热、滴加镜油和擦镜的步骤，故无论在操作流程或者成本上都比Z－N法略胜一筹。

直接痰涂片染色镜检时，LED法检测比Z－N法具有读片时间短、操作容易、检出率高（特别是对含菌量少的痰标本）、费用低等优点，是一种检查结果可靠、敏感度较高、工作效率高的方法，所以更适合结核病实验室开展。痰涂片的某些杂质经过荧光染色在LED镜下都呈现与结核分枝杆菌相似的黄色杆状或短棒状，这就需要很有读片经验的人来区分细菌与杂质，包括治疗前后细菌形态的变化，读片的人要熟练掌握和识别抗酸杆菌的形态，所以对没有荧光镜检经验的实验室，在开展LED方法前，有必要开展荧光涂片和读片培训。

［1] 中国防痨协会基础专业委员会.结核病诊断实验室检验规程.北京：中国教育文化出版社，2006：13－29.

［2] 中国疾病预防控制中心.中国结核病防治规划痰涂片镜检质量保证手册.北京：中国协和医科大学出版社，2004：23－51.

［3] Albert H，Manabe Y，Lukyamuzi G，et al.Performance of three LED－based fluorescence microscopy systems for detection of tuberculosis in Uganda.PLoS One，2010，5（12）：e15206.

［4] 尚美，刘冠，赵立平，等.发光二极管荧光显微镜实验室诊断效果评价.中国防痨杂志，2010，32（5）：275－278.

［5] Anthony RM，Kolk AH，Kuijper S，et al.Light emitting diodes for auramine O fluorescence microscopic screening of Mycobacterium tuberculosis.Int J Tuberc Lung Dis，2006，10（9）：1060－1062.