环磷酸腺苷葡甲胺诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的实验研究*

周 荣， 姚 巍， 李彦红， 王凤芝

(山西医科大学第二医院心内科，山西太原030001)

诱导骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)分化为心肌细胞一直是干细胞移植治疗心脏病的研究热点[1]。然而，由于这类细胞鱼目混珠，其中能真正发挥治疗作用的干细胞数量较少且多变，使植入细胞存活数量少，分化率低，致其对心肌梗死和心衰患者的远期疗效受到很大限制。环磷酸腺苷(3'，5'-cyclic adenosine monophosphate，cAMP)作为第二信使在体内发挥重要的生理作用。研究表明cAMP参与调节细胞的增殖与分化，但其作用因细胞类型不同而各异。环磷酸腺苷葡甲胺(meglumine cyclic adenylate，MCA)是环磷酸腺苷类似物，在临床上主要用于心力衰竭的治疗。本研究将MCA加入细胞培养液中干预BMSCs的培养，探讨其对细胞活性和心肌特异性基因表达的影响，旨在寻找一种能提高BMSCs存活并促进其分化的干预因子，为在体研究提供相关理论依据。

材料和方法

1 动物

健康Wistar远交群大鼠，6-7周龄雄鼠，体重160-170 g左右。山西医科大学实验动物中心提供。

2 试剂

MCA 购自江苏万邦生化医药股份有限公司;PKA抑制剂H89 购自 Sigma;PrimeScript RT reagent kit、SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒购自TaKaRa;兔抗大鼠心肌钙蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)IgG购自Santa cruz;大鼠环磷酸腺苷ELISA试剂盒购自RapidBio。5-氮杂胞苷(5-azacytidine，5-Aza)购自Sigma。

3 方法

3.1 BMSCs的分离、培养和鉴定 将大鼠断颈处死，用75%乙醇浸泡10 min，无菌取双侧股、胫骨，去除附着组织，剪去骨的两端，接装有PBS的注射器，反复冲出骨髓至骨体变白。冲出的骨髓吹打成细胞悬液后，以1 500 r/min离心10 min后，弃去上清，在沉淀中加入适量DMEM培养液，吹打成细胞悬液并接种于培养瓶中进行培养。72 h首次换液，以后每2-3 d换液1次。待细胞长满瓶底的80%以上时，用0.25%胰酶消化，按1∶2或1∶3比例传代备用。用流式细胞仪检测BMSCs的表面标志 CD71、CD44、CD45。

3.2 各浓度梯度MCA-细胞培养液的配制 取MCA原液浓度为5.72×10-2mol/L。用细胞培养液配制成浓度分别为1 ×10-2mol/L、1 ×10-3mol/L、10-4mol/L、10-5mol/L、1 ×10-6mol/L和1×10-7mol/L的MCA细胞培养液。

3.3 MTT比色法 取第3代细胞消化后，用含血清的培养液制成单细胞悬液接种于96孔培养板，加入含6个浓度梯度的MCA细胞培养液，分别培养24 h、48 h。加入MTT(5.0 g/L)10 μL/well、置入培养箱孵育4 h，离心弃上清，加入二甲基亚砜200 μL，采用酶联免疫检测仪测定各孔吸光值(A值)。增殖抑制率=1-(实验孔A值-空白孔A值)/(对照孔A值-空白孔A值)，根据增殖抑制率评价对细胞活性的影响。

3.4 ELISA测定细胞内cAMP水平 取第3代细胞接种于6孔板内，分别给予10-3、10-4、10-5mol/L MCA无血清细胞培养液，于给药后 2 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 收集细胞:吸弃培养液，冰 PBS冲洗1次，加入0.05 mol/L HC1(1010/L)，10 min左右终止反应。待细胞溶解后收集细胞，调整pH值至7.0，4℃、1 200 r/min离心10 min，取上清。按照大鼠环磷酸腺苷ELISA试剂盒说明测定细胞内cAMP水平。

3.5 各浓度MCA诱导BMSCs分化 取第3代细胞接种于6孔板内，分别给予 10-3mol/L、10-4mol/L、10-5mol/L MCA细胞培养液干预24 h，后换成普通培养液，培养至1周，收集细胞利用荧光定量PCR法测定心肌特异性基因表达情况。

3.6 10-3mol/L MCA作用不同时间对BMSCs分化的影响取第3代BMSCs，待完全贴壁，换成10-3mol/L MCA细胞培养液，分别干预1、3、5、7、9 d。同时给予 10 μmol/L 5-Aza 细胞培养液诱导24 h作为阳性对照和普通培养液作为空白组。各组诱导时间结束后更换为普通培养液，继续培养至4周，收集细胞。利用荧光定量PCR法测定心肌特异性基因表达情况。

3.7 BMSCs分化率测定 取第3代BMSCs，接种于6孔板内。实验共分3组:10-3mol/L MCA组、5-Aza组和空白组，培养2周后，采用流式细胞术测定cTnI阳性标记的细胞占细胞总数的百分比。

3.8 PKA抑制剂H89对MCA诱导BMSCs分化的影响 取第3代BMSCs，接种于6孔板内。实验共分3组:(1)MCA组:给予10-3mol/L MCA的细胞培养液培养3 d;(2)H89+MCA组:给予25 μmol/L H89培养液30 min，再换成 10-3mol/L MCA诱导培养液培养3 d;(3)空白组:给予普通培养液培养。各组诱导时间结束后更换为普通培养液，继续培养至4周，收集细胞测定心肌特异性基因表达情况。

3.9 荧光定量PCR测定心肌特异性基因表达 提取细胞总RNA，RT反应条件:37℃ 15 min(RT)，85℃ 5 s(反转录酶的失活反应)。紫外吸收测定法测定cDNA计算浓度。按组份配制荧光定量PCR反应液，进行real-time PCR反应:扩增程序及参数为:预变性 Reps 1，95℃ 30 s;PCR反应:Reps 40，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30-34 s;Reps 1，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min。使用StepOne软件中的Design Wizard工作流程设计实验，为实验输入设计参数。Applied Biosystems仪器运行实验。结果判定及计算:(1)熔解曲线:Tm值＞80℃，单峰认为扩增为特异性;(2)相对定量结果计算(2-ΔΔCt法):ΔCt目的基因=Ct目的基因-CtGAPDH，ΔΔCt=ΔCt目的基因-ΔCt对照组。引物序列见表1。

4 统计学处理

表1 引物序列Table 1.Sequences for primers

结 果

1 BMSCs生长特性及鉴定

培养1 d后可见到少量细胞贴壁;培养第3 d大部分细胞为梭形或多角形细胞呈贴壁生长;7 d可见散在分布的形态相对均一的梭形细胞，部分排列呈现有规则的集束辐射状;15 d到20 d细胞基本融合，呈漩涡状排列，细胞之间界限不清。传代的细胞形态类似成纤维细胞，生长分布均匀，传代后细胞增殖速度明显增快，多次传代后细胞形态均一，见图1。流式细胞仪检测BMSCs表面标志结果显示:贴壁生长的细胞表达 CD44(98.46%)和 CD71(68.63%)，而不表达CD45(1.24%)，见图 2。

2 MCA对BMSCs细胞活性的影响

Figure 1.Phase contrast microscopic observation of cultured BMSCs(×200):A，B:primary BMSCs after 2 weeks and 3 weeks，respectively;C，D:passage 3 BMSCs after 24 h and 1 week，respectively.图1 BMSCs的生长形态

Figure 2.The surface marker of passage 3 BMSCs detected by flow cytometry.CD44 and CD71 were positive，while CD45 was negative.图2 流式细胞仪检测BMSCs表面标志CD44、CD71和CD45的表达

随着MCA浓度的逐渐增大，A490逐渐减小。10-2、10-3、10-4、10-5mol/L浓度组A值与空白组相比差异显著(P＜0.05);10-6、10-7mol/L浓度组A值与空白组相比无显著差异(P＞0.05)。通过公式计算细胞增殖抑制率均为负值，表明不同浓度的该药物对BMSCs的活性呈抑制作用，并表现为时间和剂量依赖性，其中10-2mol/L MCA对细胞的抑制作用尤为显著，见表2。

3 MCA对BMSCs细胞内cAMP水平的影响

各浓度组在各时点的细胞内cAMP浓度较空白组明显升高，且随着MCA浓度的升高，细胞内cAMP浓度也升高。比较各时点cAMP浓度，发现给药6 h后cAMP浓度达高峰，随后逐渐下降，至72 h最低，见表3。

4 MCA干预后对BMSCs表达心肌特异性基因的影响

GATA-4、β-MHC和Cx43 mRNA的表达在MCA各浓度组与空白组相比都有所升高(P＜0.05);其中GATA-4、β-MHC mRNA在MCA10-3mol/L组明显高于其它2个浓度组，差异显著(P＜0.05)。Cx43 mRNA表达量在MCA 10-5mol/L最高，其次是MCA 10-3mol/L组(P＜0.05)，见表4。

表2 各浓度MCA作用24 h和48 h对BMSCs活性的影响Table 2.The effect of different concentrations of MCA on viability of BMSCs in 24 h and 48 h(±s.n=18)

表2 各浓度MCA作用24 h和48 h对BMSCs活性的影响Table 2.The effect of different concentrations of MCA on viability of BMSCs in 24 h and 48 h(±s.n=18)

*P＜0.05 vs blank group;#P＜0.05 vs MCA 10-2mol/L group.

Group 24 h 48 h Blank 0.569±0.077 0.687±0.035 MCA 10-2mol/L 0.481±0.039* 0.485±0.017*MCA 10-3mol/L 0.502±0.017*# 0.521±0.013*#MCA 10-4mol/L 0.515±0.042*# 0.546±0.014*#MCA 10-5mol/L 0.539±0.049*# 0.554±0.012*#MCA 10-6mol/L 0.551±0.015 0.574±0.019 MCA 10-7mol/L 0.561±0.025 0.591±0.044

表3 各浓度MCA在各作用时点BMSCs细胞内cAMP水平Table 3.The cAMP level in BMSCs treated with different concentrations of MCA at different time points(nmol/L.±s.n =6)

表3 各浓度MCA在各作用时点BMSCs细胞内cAMP水平Table 3.The cAMP level in BMSCs treated with different concentrations of MCA at different time points(nmol/L.±s.n =6)

*P ＜0.05 vs blank group.

Group 2 h 6 h 12 h 24 h 48 h 72 h MCA 10-3mol/L 32.12±0.47* 47.27±0.34* 37.19±0.33* 34.41±0.24* 33.43±0.20* 30.01±0.39*MCA 10-4mol/L 22.29±0.39* 33.02±0.30* 28.86±0.25* 28.73±0.21* 21.95±0.56* 19.73±0.36*MCA 10-5mol/L 15.87±0.35* 27.21±0.42* 26.03±0.31* 25.32±0.19* 20.28±0.36* 15.06±0.27*Blank 5.34±0.17 5.84±0.12 5.41±0.34 5.32±0.31 5.38±0.16 5.65±0.42

表4 各浓度MCA对BMSCs心肌特异性基因表达的影响Table 4.Expression of myocardium-specific genes after different concentrations of MCA induced BMSCs into myocardium(±s.n=6)

表4 各浓度MCA对BMSCs心肌特异性基因表达的影响Table 4.Expression of myocardium-specific genes after different concentrations of MCA induced BMSCs into myocardium(±s.n=6)

*P＜0.05 vs blank group;#P＜0.05 vs MCA 10-4mol/L group and 10-5mol/L group.

Group GATA-4 mRNA β-MHC mRNA Cx43 mRNA Blank 0.86±0.46 0.65±0.38 0.83±0.19 MCA 10-3mol/L 33.08±1.77*#22.98±6.36*# 7.51±0.61*MCA 10-4mol/L 4.79±0.63* 14.32±4.34* 3.98±1.31*MCA 10-5mol/L 2.56±0.32* 7.95±2.71* 12.19±0.42*

5 MCA作用不同时点心肌特异性基因的表达

10-3mol/L MCA作用3 d和5 d的2组在培养4周时GATA-4、β-MHC、Cx43 mRNA表达量高于其它3组(P＜0.05)。其中MCA诱导3 d组略高于诱导5 d组，见表5。

表5 10－3mol/L MCA诱导不同时点BMSCs心肌特异性基因的表达Table 5.Expression of myocardium-specific genes after 10-3 mol/L MCA induced BMSCs into myocardium in different time points(±s.n=6)

表5 10－3mol/L MCA诱导不同时点BMSCs心肌特异性基因的表达Table 5.Expression of myocardium-specific genes after 10-3 mol/L MCA induced BMSCs into myocardium in different time points(±s.n=6)

*P＜0.05 vs 1 d group;#P＜0.05 vs 7 d and 9 d group;▲P＜0.05 vs 5 d group.

Induction time Cultured 4weeks GATA-4 mRNA β-MHC mRNA Cx43 mRNA 1 d 49.12±3.17 42.22±3.77 19.93±1.43 3 d 74.69±4.36*# 65.44±4.04*#▲ 30.12±2.19*#▲5 d 70.18±3.05*# 59.88±3.12*# 25.45±1.56*#7 d 62.62±3.55* 40.76±3.16* 17.70±2.42*9 d 57.36±5.16* 39.68±2.94* 10.75±4.11*

6 MCA和5－Aza对BMSCs分化作用的比较

MCA组、5-Aza组与空白组相比，GATA-4、β-MHC和Cx43 mRNA的表达增高;GATA-4和β-MHC mRNA在MCA组较5-Aza组的表达量增多(P＜0.01)，见表6。流式细胞仪测定诱导分化率:MCA组诱导分化率略高于5-Aza组的诱导分化率(20.24% ±1.02%vs 18.39% ±0.58%，P＜0.05)。

7 给予PKA抑制剂H89对心肌特异性基因表达的影响

MCA组与空白组相比GATA-4、β-MHC和Cx43 mRNA的表达量显著增加(P＜0.01);给予H89后，H89+MCA组GATA-4、β-MHC和Cx43 mRNA的表达量较MCA组显著减少(P＜0.01);GATA-4、β-MHC和 Cx43 mRNA这3种基因在H89+MCA组也有所表达，并且与空白组相比有显著差异(P＜0.01)，见表7。

表6 比较MCA和5－Aza诱导BMSCs后心肌特异性基因的表达情况Table 6.Expression of myocardium-specific genes after MCA or 5-Aza induced BMSCs into myocardium(±s.n=6)

表6 比较MCA和5－Aza诱导BMSCs后心肌特异性基因的表达情况Table 6.Expression of myocardium-specific genes after MCA or 5-Aza induced BMSCs into myocardium(±s.n=6)

*P＜0.05 vs blank group;#P＜0.05 vs 5-Aza group.

Group GATA-4 mRNA β-MHC mRNA Cx43 mRNA Blank 0.69±0.51 0.86±0.12 1.31±0.19 MCA 51.31±2.33*# 30.94±2.13*# 15.80±1.39*5-Aza 35.48±2.24* 19.06±1.54* 11.86±1.02*

表7 给予PKA抑制剂H89干预MCA诱导BMSCs后心肌特异性基因的表达情况Table 7.Expression of myocardium-specific genes with PKA inhibitor H89 treatment after MCA induced BMSCs into myocardium(±s.n=6)

表7 给予PKA抑制剂H89干预MCA诱导BMSCs后心肌特异性基因的表达情况Table 7.Expression of myocardium-specific genes with PKA inhibitor H89 treatment after MCA induced BMSCs into myocardium(±s.n=6)

*P＜0.05 vs blank group;#P＜0.05 vs MCA group.

Group GATA-4 mRNA β-MHC mRNA Cx43 mRNA MCA 33.08±1.27* 30.94±2.13* 15.80±1.39*H89+MCA 15.63±0.64*# 10.46±1.13*# 4.46±0.62*#Blank 0.86±0.46 0.65±0.38 1.14±0.74

讨 论

BMSCs能够分化为心肌细胞早已被国内外学者所认识，并有大量国内外研究证实其能分化为心肌细胞[2]，分化的细胞具有相似的动作电位和形成闰盘结构[3]。但是BMSCs移植中存在一些影响治疗效果的问题，如移植细胞存活率低、分化率低。目前公认的能诱导BMSCs分化为心肌细胞的化学诱导剂是5-Aza，其诱导分化率最高也仅30%，但是其有毒不能用于在体的诱导分化[4]，因此大批的学者致力于探究能用于人体的、提高BMSCs定向分化因素的研究[5]。

cAMP是体内重要的第二信使，参与细胞的代谢、生长、分化和凋亡等[6]。经典的 cAMP主要是通过蛋白激酶 A(protein kinase A，PKA)信号通路发挥作用。研究已证实cAMP/PKA信号转导通路能促进心肌早期转录因子GATA-4[7，8]和连接蛋白 Cx43的表达。GATA-4是干细胞向心肌细胞分化的重要启动因素[9]，参与调节心肌细胞结构基因和相关调控基因的表达。Cx43具有非通讯功能，可调节细胞的生长、增殖、分化、凋亡等生物学过程[10]。研究表明增加细胞内cAMP的水平能促进Cx43的磷酸化，增加Cx43的表达以及调控Cx43的细胞间通讯[11]。MCA是环磷酸腺苷类似物，葡胺作为配基与cAMP结合，可增强cAMP的脂溶性，使cAMP易于通过细胞膜，提高细胞内cAMP浓度，使cAMP的作用得到充分的发挥[12，13]。基于以上的理论依据，本课题从细胞水平研究MCA对BMSCs向心肌细胞分化的影响，以期为提高干细胞移植的临床疗效提供新思路和靶点。

本实验观察到随着MCA浓度的逐渐增大，细胞活性逐渐减少，说明该药物对BMSCs的活性呈抑制作用。在抑制细胞活性的过程中，没有观察到细胞死亡现象。MCA抑制BM-SCs活性表现为时间和剂量依赖性。研究表明MCA能够通过细胞膜进入BMSCs细胞内，升高细胞内cAMP的浓度，且呈浓度依赖性。研究发现经MCA干预后BMSCs心肌特异性基因GATA-4、β-MHC和Cx43表达增多，表明MCA具有诱导BMSCs向心肌样细胞分化的能力。深入研究其量效关系，可见10-3mol/L浓度的MCA诱导干预3 d能发挥最佳的诱导分化作用。同时研究中也发现不是诱导的时间越长诱导效果越好，这可能与环磷酸腺苷对细胞分化的复杂作用有关。目前公认的化学诱导剂为5-Aza，因此我们选用5-Aza作为阳性对照，运用荧光定量RT-PCR法比较心肌特异性基因表达量和流式细胞术测定两者干预后BMSCs表达心肌特异性cTnI的阳性细胞率，可见MCA组表达量和阳性细胞略高于5-Aza组，再一次说明MCA有诱导分化的作用，且这种作用略强于5-Aza。

cAMP对细胞的生物效应主要是通过激活PKA来实现。PKA属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，通过磷酸化调节多种蛋白质，包括转录因子的活性，对细胞分化和生长起着调节作用。经典的cAMP/PKA信号转导通路为:cAMP→依赖cAMP的蛋白激酶A(PKA)→基因调控蛋白→基因转录。目前有关cAMP/PKA通路与干细胞向心肌细胞的分化没有受到关注，更没有与临床应用药物相结合。有报道[14]在培养基中加入不同浓度的cAMP与胚胎干(embryonic stem，ES)细胞共同培养，能增加搏动细胞的数量，RT-PCR分析显示ES细胞在经与cAMP联合培养后能表达心肌细胞特异性标记物GATA-4、NKX2.5、β-MHC和ANF。但在这项研究中没能就诱导分化的机制进行深入探讨。

H89是一种常用的PKA抑制剂，可以通透细胞，选择性抑制cAMP依赖的蛋白激酶PKA、PKG和PKCμ，但对于PKA的选择性抑制作用更强。本研究中给予H89作用30 min后，再用MCA诱导，发现心肌特异性基因GATA-4、Cx43和β-MHC mRNA表达明显减少;虽然有H89的抑制作用，但是仍发现BMSCs还能少量表达GATA-4、Cx43和β-MHC mRNA，说明H89能部分抑制MCA的诱导分化的作用，这与cAMP除了主要通过cAMP/PKA信号通路发挥作用，还可通过其它信号通路(如ERK通路)发挥作用有关，这些相关信号通路的作用有待深入研究。

从以上结果，我们可以推论MCA可以进入BMSCs内，升高细胞内cAMP水平，主要通过cAMP/PKA信号通路发挥诱导分化作用。至于BMSCs分化为心肌细胞的具体机制尚需深入研究。

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