川芎嗪与氨基胍联合治疗对n0－STZ大鼠肾功能的影响*

窦橙云， 王蔚琛， 曹创杰， 魏树珍， 李瑞峰△

(1山东大学医学院病理生理学研究所，山东济南250012;2滨州医学院病理生理学教研室，山东烟台264003;3济南市中心医院妇产科，山东济南250013)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病微血管病变导致的肾小球硬化，是糖尿病(diabetes mellitus，DM)的主要并发症之一，也是DM常见的死亡原因之一。DN发病机制复杂，目前普遍认为DN涉及遗传因素、糖代谢异常、血流动力学异常、细胞因子调节障碍、炎症介导、氧化应激等多因素多环节，最近硝化应激成为研究DN的热点。

NO在众多病理生理过程中发挥着介质和信使的功能。胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)时，高血糖激活诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)产生过量NO，与超氧阴离子(O－·2)反应生成过氧化亚硝酸盐阴离子ONOO－，ONOO－与游离的酪氨酸或蛋白质中的酪氨酸残基反应生成3－硝基酪氨酸(3－nitrotyrosine，3－NT)。3－NT是体内活性氮簇(reactive nitrogen species，RNS)的生物标志，其含量代表组织内硝基化应激的水平。3－NT具有细胞毒性，对蛋白质、脂质和 DNA等具有很强的氧化能力，从而损伤组织。体外实验证实因胰岛素受体底物 －1(insulin receptor substrate－1，IRS－1)的酪氨酸残基被ONOO－硝基化，导致胰岛素转导信号中断，造成高糖血症。但链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)所诱导的出生当天大鼠(neonatal－0 streptozotocin－induced rats，n0－STZ大鼠)体内硝基化应激状况及肾损害机制还鲜有报道。

本课题组前期研究显示单用川芎嗪或单用氨基胍治疗，无论在降低n0－STZ大鼠空腹血糖、血浆胰岛素及胰岛素抵抗指数方面，还是降低血浆NO水平、iNOS表达、糖化血清蛋白方面，均不及两药合用效果显著[1]。本研究拟进一步观察川芎嗪与氨基胍联合应用对n0－STZ大鼠肾损害的保护效果与机制。

材料和方法

1 材料

1.1 实验动物 出生当日的Wistar大鼠100只，体重约60 g，山东大学实验动物中心提供。幼鼠先由母鼠喂养，4周龄后予普通饲料喂养，自由摄水摄食。室内温度控制在(22±3)℃，维持12/12 h的白天/黑夜交替。

1.2 试剂 STZ购于Sigma;氨基胍购于上海达瑞精细化学品有限公司;川芎嗪购于天津药业集团新郑股份有限公司;二甲双胍由北京京丰制药提供;3－NT(39－6)抗体为Santa Cruz产品;iNOSⅠ抗由北京博奥森生物技术有限公司提供;一氧化氮和一氧化氮合酶测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。

2 方法

2.1 n0－STZ大鼠模型制备 出生当日的Wistar大鼠100只，随机选取80只，一次性腹腔内注射STZ 90 mg/kg，余20只作为正常对照组(NC)，腹腔内注射等体积的生理盐水。8周龄时，空腹血糖≥7.0 mmol/L者，选入本实验。将n0－STZ大鼠随机分为胰岛素抵抗(IR)组、二甲双胍(MET)治疗组、川芎嗪+氨基胍(TMP+AG)联合治疗组，每组20只，继续喂养。MET组每日经饮水摄入二甲双胍125 mg/kg;TMP+AG组每日经饮水摄入川芎嗪50 mg/kg、氨基胍25 mg/kg;分雌雄2组喂养24周，观察大鼠一般情况。

2.2 血液生化检查 32周龄，全部大鼠摘取眼球采血处死，留取血清、血浆检测空腹血糖(fasting plasm glucose，FPG)、空腹胰岛素(fasting insulin，FINS)。根据公式IRI=(FPG×FINS)/22.5计算胰岛素抵抗指数(insulin resistance index，IRI)。酶学法检测血清尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)和肌酐(creatinine，Cr)。

2.3 尿液检查 32周龄时，收集24 h尿液，测尿蛋白、尿肌酐。以内生肌酐清除率反映肾小球滤过率(glomerular filtration rate，GFR):GFR=(尿肌酐 × 尿量)/血肌酐。

2.4 NO活性和iNOS浓度检测 10%肾组织匀浆，依次加入试剂充分混匀，490 nm(NO)或530 nm(iNOS)波长测各管吸光度值。

2.5 外周血白细胞iNOS mRNA检测 提取白细胞，加入探针杂交液，anti－DIG －AP，NBT/BCIP，37℃避光显色2 h，核固红复染，封片。

2.6 HE染色 肾组织切片HE染色，观察形态学变化。

2.7 免疫组化 常规脱蜡水化，Ⅰ抗4℃过夜(iNOS 1∶50;3 －NT 1∶100)，PBS 代替Ⅰ抗作阴性对照，DAB显色。

2.8 Western blotting检测 iNOS和3－NT 10%凝胶，加样40 μg，电泳、湿转、封闭、Ⅰ抗4 ℃过夜、Ⅱ抗37℃孵育1 h，暗室曝光显影。

3 统计学处理

应用GraphPad Prism 5软件，数据以均数±标准差(±s)表示，各组间采用单因素方差分析，采用Kaplan－Meier法估计生存率，生存率曲线采用logrank检验进行假设检验。

结 果

1 n0－STZ大鼠成模情况

8周龄时，80只大鼠中有66只FPG≥7.0 mmol/L，成模率为82.5%，死亡率为0。该组大鼠尿量增多，体重增加，皮毛色黄、缺少光泽，活动量少，FPG、FINS和IRI明显升高，接近IR疾病状态。

2 各组大鼠生存率比较

32周龄时，NC组存活20只，存活率100%，IR组存活7只，存活率35%，MET组存活14只，存活率70%，TMP+AG组存活17只，存活率85%。IR组、MET组生存率明显低于NC组(P＜0.05)，MET组和TMP+AG组生存率明显高于IR组(P＜0.05)，MET组和TMP+AG组间生存率差异无显著，见图1。

Figure 1.The survival curves of rats in different groups.图1 各组大鼠生存率曲线

3 各组大鼠FPG、FINS和IRI的变化

32周龄时IR组的FPG明显高于NC组(P＜0.05)，MET组和TMP+AG组较IR组显著下降(P＜0.05);IR组FINS高于NC组(P＜0.05)，TMP+AG组低于IR组(P＜0.05)，还低于MET组(P＜0.05)，但是高于NC组(P＜0.05)，表明和二甲双胍相比，联合治疗更能显著降低胰岛素浓度;对于IRI，IR组明显高于NC组，MET组和TMP+AG组远低与IR组(P＜0.05)，但是TMP+AG组的疗效优于MET组(P＜0.05)，说明联合治疗在提高胰岛素敏感性方面更具优势，见表1。

表1 各组大鼠空腹血糖、空腹胰岛素和胰岛素抵抗指数水平Table 1.The levels of FPG，FINS and IRI of rats in different groups

4 各组大鼠肾功能变化

和NC组相比，IR组BUN、血Cr和尿蛋白的量显著增加(P＜0.05)，GFR明显下降(P＜0.05);MET组和TMP+AG组BUN、血清Cr、尿蛋白的量明显低于IR组(P＜0.05)，GFR有所提高(P＜0.05);与MET组比较，TMP+AG组更能降低血清BUN、Cr和尿蛋白，提高肾小球的滤过功能(P＜0.05)，见表2。

表2 各组大鼠血清尿素氮、血清肌酐、尿蛋白、肾小球滤过率的比较Table 2. Comparison of BUN，serum Cr，urine albumin and GFR among different groups

5 各组大鼠NO浓度和iNOS活性变化

IR组的NO浓度和iNOS活性较NC组明显增加(P＜0.05)，TMP+AG组在降低NO浓度和iNOS活性方面稍强于MET组(P＜0.05)，见图2。

Figure 2.The NO concentration(A)and iNOS activity(B)of rat in different groups.±s.NC:n=20;IR:n=7;MET:n=14;TMP+AG:n=17.*P ＜ 0.05 vs NC group;#P ＜0.05 vs IR group;△P ＜0.05 vs MET group.图2 各组NO浓度和iNOS活性比较

6 原位杂交

NC组外周血白细胞无iNOS mRNA表达，IR组外周血白细胞iNOS mRNA表达增高，MET组阳性率略低于IR组，TMP+AG组阳性率显著降低，见图3。

Figure 3.The iNOS mRNA －positive cells in peripheral blood leucocyte(×1 000).The dark blue cells were positive ones.A，B，C，D:NC(0.0±0.0)，IR(37.61% ±9.81%)，MET(20.85% ±5.17%)and TMP+AG(13.33% ±3.80%)groups，respectively.图3 外周血白细胞iNOS mRNA阳性细胞

7 HE染色

NC组肾小管、肾小球结构完整，组织形态学正常，IR组肾小管萎缩、退化、排列紊乱，间质纤维组织增生，肾小球体积增大，系膜基质含量增加，治疗组形态较IR组有明显改变，联合治疗组的组织学形态向正常状态转变，见图4。

Figure 4.The HE staining of kidneys and immunohistochemical staining of iNOS and 3－NT in kidneys(×400).PBS was a negative control instead of primary antibodies.A，B，C，D:NC，IR，MET and TMP+AG groups，respectively.图4 各组肾脏组织HE染色，3－NT、iNOS免疫组化染色

8 免疫组化

3－NT:NC组中肾小管可见少量的棕黄色颗粒，肾小球中未见表达;IR组不仅棕黄色颗粒显著增加，而且颗粒也增粗，但都集中在肾小管，肾小球仍未见。MET组的颗粒较IR组明显减少，TMP+AG组的免疫染色较弱，接近于NC组，见图4。

iNOS:NC组未见iNOS的表达，即棕黄色物质的沉积。IR组肾小管中可见棕黄色物质，MET组表达量减少，TMP+AG则明显减少。4组肾小球中均未见表达，见图4。

9 Western blotting结果

3－NT:NC组可表达一定量3－NT，但是IR组更多(P＜0.05);相较于IR组，MET组和TMP+AG组明显减少(P＜0.05)，但MET组和TMP+AG组的差异不明显，见图5。

Figure 5.The expression of iNOS and 3－NT in each group.β－actin served as internal control.±s.NC:n=20;IR:n=7;MET:n=14;TMP+AG:n=17.*P ＜0.05 vs NC group;#P ＜0.05 vs IR group;△P ＜0.05 vs MET group.图5 各组肾组织中iNOS、3－NT、β－actin的表达结果

iNOS:NC组表达量非常少，IR组明显提高(P＜0.05)，MET组比 IR组减少(P＜0.05)，TMP+AG组进一步减少(P＜0.05)，说明联合治疗在降低iNOS含量方面优于二甲双胍(P＜0.05)，见图5。

讨 论

对于糖尿病及其并发症的研究，建立合理的动物模型非常重要。现阶段诱导T2DM模型的方法多种多样，包括食物喂养、药物诱导、病毒感染、手术损伤、转基因动物等。与传统的成年动物模型不同的是，本研究用出生当日的Wistar大鼠。注射STZ后的结果显示，FPG、FINS和IRI在造模8周后与 NC组相比明显升高。该模型除了不具备遗传易感性，其它特征与临床IR及T2DM的早期表现非常接近，且价格低廉、生存率高、制备周期短，是研究IR发生发展及防治的理想模型[2]。32周龄时，和NC组相比，IR组血BUN、血Cr、尿蛋白的量显著增加，GFR明显下降，HE染色显示肾小管萎缩、退化、排列紊乱，间质纤维组织增生，肾小球体积增大，系膜基质含量增加。给予川芎嗪与氨基胍联合治疗后，肾功能及其形态学损伤均得到明显改善，提示联合治疗可以延缓或阻止糖尿病大鼠肾功能和病理学损害。

有关糖尿病肾功能受损的详尽机制尚没有完全阐明。尿蛋白是DN的标志，也是肾功能受损的一个重要的预测因子。国内学者发现即使在DN的早期，足细胞的数目、密度以及细胞质的覆盖面积均明显降低[3]，细胞间隙增大，微蛋白尿产生;巨噬细胞通过分泌白细胞介素 －1β(interleukin－1β，IL－1β)和肿瘤坏死因子 α(tumor necrosis factor α，TNF － α)，激活磷脂酰肌醇3－激酶(phosphatidylinositol 3－kinase，PI3K)/蛋白激酶 B(protein kinase B，PKB/Akt)信号通路，参与蛋白尿的形成。高糖诱导产生的自由基下调超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽过氧化酶(glutathione peroxidase，GSH －Px)的表达，激活 NF － κB[4]。NF － κB诱导糖尿病个体的肾小球系膜细胞、肾小管细胞、足细胞表达多种炎症介质，如TNF－α、IL－6，促进转化生长因子 β1(transforming growth factor－β1，TGF －β1)的释放引起系膜细胞的增殖和肾小管纤维化，还可以导致肾脏炎症级联反应的加剧，进一步恶化肾功能。适度的内质网应激对机体有益[5]，但过度时会通过TNF受体相关因子2(TNF receptor－associated factor 2，TRAF－2)、真核起始因子(eukaryotic initiation factor，eIF)－α和活化转录因子6(active transcriptional factor，ATF6)－PI3K/Akt通路激活 NF－κB，引起肾功能障碍。Drel等[6]发现多聚 ADP－核糖多聚酶(poly ADP－ribose polymerase，PARP)的活化提高了尿中丙二醛和3－NT含量，参与DN的发生。PARP抑制剂通过减轻足细胞的丢失和TGF－β的增加，阻止STZ－DM大鼠的蛋白尿、肾小球系膜的增生和胶原沉着[7]，也提示 PRAP参与DN的发生。本研究从NO、iNOS和3－NT三者间的相互关系出发，证实IR组不仅外周血白细胞iNOS mRNA表达增高，而且肾组织中NO浓度增加，iNOS活性升高，iNOS和3－NT表达增多。IR时不仅存在过多的NO，而且由于生成3－NT的过程中消耗了NO，造成iNOS活性升高，进一步刺激NO生成，形成恶性循环，进而加重肾功能损害。

本研究发现，二甲双胍和联合治疗均能通过下调iNOS的活性，降低NO的浓度，减少3－NT的生成，明显改善n0－STZ大鼠的肾功能，但联合治疗效果更优，进一步佐证DN肾功能的损伤程度的确与硝化应激有关。但其药理机制还未完全阐明。川芎嗪可降低糖尿病肾皮质晚期糖晚期糖基化终产物(advanced glycation end products，AGEs)含量，抑制醛糖还原酶活性，调节凋亡相关蛋白Bcl－2的表达，抑制肾脏细胞凋亡[8];减少 IL －6、TNF － α、TGF － β1等的表达，抑制成纤维细胞增殖和胶原蛋白合成，延缓肾小球硬化[9];减少蛋白尿排泄，降低肾间质中骨桥蛋白表达，从而减轻肾间质损害[10]。氨基胍是iNOS的抑制剂，抑制NO生成;可抑制糖基化牛血清白蛋白(AGE－BSA)的生物效应，降低受激活调节正常T细胞表达和分泌因子水平，降低尿白蛋白，减轻肾系膜增生和肾小球肥大[11];抑制大鼠肾组织Ⅳ型胶原和TGF－β的表达，增强BMP－7和Smad5的表达，拮抗肾间质的纤维化[12];增加二酰甘油(diacylglycerol，DAG)激酶活性，促使DAG转化为磷脂酸，降低DAG水平，下调PKC活性而保护肾脏[13];减少肾小球乳过氧化物酶水平，降低肾脏氧化应激水平[14]。川芎嗪与氨基胍的联合治疗，不仅在抗氧化方面发挥协同作用，而且下调iNOS活性，抑制NO及3－NT生成，拮抗硝基化作用。联合治疗是否通过其它途径缓解DN时的肾功能受损，还需要进一步研究。

本实验研究发现，川芎嗪与氨基胍的联合治疗可减轻DN的肾功能损伤，其机制之一可能与抑制硝化应激有关，为DN发病机制的研究提供新的思路。

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