重组人补体受体1型SCR15－18片段对肠缺血再灌注损伤的保护作用*

汪晓艳， 刘高科， 何 莉， 汪正清△

(1第三军医大学基础部微生物教研室，重庆400038;2重庆市结核病防治所，重庆400050)

肠道黏膜免疫屏障在防御细菌及毒素等入侵时起重要作用。严重创伤、感染及休克可导致肠缺血再灌注损伤(ischemia/reperfusion，I/R)，使肠内细菌和毒素移位，引起肠源性感染和炎症损伤，严重者可导致全身炎性反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)和多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)[1，2]。肠缺血/再灌注损伤的发生机制和防治是亟待解决的问题。肠I/R损伤的发生机制比较复杂，近年来的研究证明，补体系统被过度激活而产生的C4a、C3a、C5a及C5b－9炎症效应片段在介导肠I/R损伤的发生发展中起着非常重要的作用[2－5]。动物实验证明，C3a、C5a的抗体和C5aR拮抗剂可减轻肠I/R损伤，但保护效果很不完全。目前国内外研究的重点多放在补体激活途径的始动环节上。抑制补体系统过度活化，以减少过量炎症效应片段生成。本室已经在毕赤酵母中成功克隆表达具有结合C3b并抑制C3/C5转化酶生物活性作用的人补体受体1型(complement receptor type 1，CR1)片段 SCR15 －18[6]，本实验采用大鼠肠I/R模型，探讨CR1－SCR15－18蛋白对肠I/R损伤的保护效应，为防治肠I/R损伤开辟新途径提供实验数据。

材料和方法

1 材料

蛋白CR1－SCR15－18按文献[6]制备，髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，小鼠抗人C3抗体购自Santa Cruz，免疫组化SP法染色试剂盒购自中衫公司，伊文氏蓝染料购自Sigma。其它试剂均为进口分装或国产分析纯。

2 方法

2.1 实验分组及动物模型的建立 随机将健康雄性(230±20)g SD大鼠(由第三军医大学实验动物中心提供)分为3组:(1)假手术组(SO)15只:开腹，分离肠系膜上动脉(superior mesenteric artery，SMA)不夹闭;(2)缺血再灌注组(I/R)15只:腹腔注射1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉后仰卧位固定，消毒后行剖腹术。分离SMA，在其根部用无创伤微血管夹夹闭，参考文献[7]缺血30 min后，移除血管夹，再灌注60 min，根据缺血小肠动脉分支搏动和小肠颜色的变化判断缺血或再灌注是否成功;(3)CR1－SCR15－18保护组(CR1)15只:参考文献[7]缺血30 min，再灌注60 min，在再灌注前5 min，腿静脉注射蛋白CR1－SCR15－18(30mg/kg，PBS溶解，浓度1%)。3组大鼠术前均禁食12 h，自由饮水。

2.2 观察指标

①血管通透性检测 根据渗入到组织中的伊文氏蓝染料的量来评价血管的通过性[8]。再灌注前2 min，Evan blue(20 mg/kg)通过大腿静脉注射(1 mL/kg)。再灌结束后取回盲部10 cm以上肠管约5 cm，剪开，37℃干燥24 h，称重后用3 mL甲酰胺室温浸泡24 h提取伊文氏蓝。620 nm处绘制伊文氏蓝的标准曲线，读取提取液中的A值，计算组织中伊文氏蓝的量，结果用“(伊文氏蓝)μg/g(组织)”表示。

②MPO、SOD活性及MDA含量测定 取小肠回盲部10 cm以上肠管，冰生理盐水洗净，吸干，－70℃冻存。MPO、SOD和MDA的测定按试剂盒说明书操作。

③组织病变观察 取小肠回盲部10 cm以上肠管，中性甲醛固定。常规石蜡切片，HE染色，光镜下观察病变。小肠损伤程度分级评分参考Chiu分级标准[9]。

④免疫组化检测补体C3原位沉积 石蜡切片后，免疫组化染色采用SP法，待测抗原为补体组分C3，Ⅰ抗为小鼠抗人C3(1∶600稀释)，Ⅱ抗为山羊抗小鼠IgG，DAB显色，苏木素复染。

3 统计学处理

结 果

1 血管通透性的变化

缺血再灌注后，小肠血管通透性发生了改变，I/R组渗透到小肠组织伊文氏蓝染料的量高于SO组(P＜0.01);与I/R组比较，CR1组渗透到小肠组织伊文氏蓝染料的量明显降低(P＜0.01)，见表1。

表1 渗透到各组大鼠小肠组织中伊文氏蓝染料量的比较Table 1.Comparison of the amount of Evans blue dye penetration into the intestinal tissues of rats(±s.n=4)

表1 渗透到各组大鼠小肠组织中伊文氏蓝染料量的比较Table 1.Comparison of the amount of Evans blue dye penetration into the intestinal tissues of rats(±s.n=4)

＊＊P ＜0.01 vs SO group;△△P ＜0.01 vs I/R group.

Group Evans blue(μg/g)SO 118.54 ±15.36 I/R 393.08 ±36.39＊＊CR1 183.24 ±31.08△△

2 肠组织MPO、SOD和MDA的变化

与SO组相比，I/R组小肠组织中MPO活性和MDA的量均显著升高(P＜0.01)，SOD活性降低(P＜0.01);CR1组的小肠中MPO活性和MDA的量均低于I/R组(P＜0.01)，SOD活性高于I/R组(P＜0.05)，见表2。

3 免疫组化结果

与SO组相比，I/R组肠缺血坏死区补体组分C3在小肠损伤的绒毛顶端和固有层部位大量沉积，CR1保护组只有少量的补体组分C3在固有层沉积，见图1。

表2 各组大鼠小肠组织中SOD、MDA和MPO水平的比较Table 2.Comparison of SOD，MDA and MPO in rat intestinal tissues in different groups(±s.n=8)

表2 各组大鼠小肠组织中SOD、MDA和MPO水平的比较Table 2.Comparison of SOD，MDA and MPO in rat intestinal tissues in different groups(±s.n=8)

*P ＜0.01，＊＊ P ＜0.05 vs SO group;△P ＜0.05，△△P ＜ 0.01 vs I/R group.

Group SOD(103U/g) MDA(μmol/g) MPO(U/g)SO 62.35 ±6.74 1.30±0.10 0.39±0.08 I/R 48.88±4.38＊＊ 1.93±0.15＊＊ 0.73±0.09＊＊CR1 55.91±7.99△ 1.46±0.09＊△△ 0.45±0.09△△

Figure 1.C3 deposition in the intestinal tissues detected by immunohistochemistry(×400).A:sham operation(SO)group;B:I/R group;C:CR1 SCR－15－18 treatment group.图1 大鼠小肠组织C3免疫组织化学染色

4 小肠组织病理学改变

图2显示，光镜下SO组肠黏膜绒毛完整，无损伤;I/R组大鼠肠黏膜顶端上皮大片坏死，脱落，大量炎症细胞浸润、黏膜固有层水肿、瘀血、细胞构成增多，靠近顶端的固有层绒毛出血和溃疡;CR1保护组组织损伤程度明显减轻，仅部分顶端上皮崩解脱落和轻度淤血。且CR1保护组损伤评分低于I/R组(P ＜0.05)。

Figure 2.The pathological changes of the intestinal tissues of rats(HE staining，×200).A:sham operation(SO)group;B:I/R group;C:CR1 SCR－15－18 treatment group.图2 大鼠小肠组织病理变化

讨 论

补体系统是天然免疫和获得性免疫的重要组成部分，具有抗微生物感染、免疫调节等多种作用。但在肠缺血再灌注等疾病中，补体过度活化[2，10]并产生大量的 C3a、C5a和 C5b－9攻膜复合体(membrane attack complex，MAC)，直接或间接介导无菌性炎症反应而加重组织损伤。因此，研发有效的补体抑制剂，抑制补体活化已成为防治肠缺血再灌注损伤的重要策略，也是临床上为防治诸多由补体过度活化所致疾病亟待解决的问题。

CR1为体内重要的补体调节因子，由30个短同源重复序列(short consensus repeats，SCR)构成，拥有3个活性位点，分别为位点I和2个拷贝的位点II[11]。其中位点 I位于 SCR1 －3，能结合 C4b，加速C3/C5转化酶的衰变，基于位点I研制的补体抑制剂APT070具有良好的抑制补体活化功能;2个拷贝的位点II分别位于SCR8－10和SCR15－17，均能结合C3b/C4b，抑制C3/C5转化酶的形成，辅助I因子裂解C3b/C4b，阻断C3a、C5a及 MAC的产生，具有抗补体治疗的潜在应用价值。在前期工作中，我们已在毕赤酵母中分泌表达出具有抑制补体活化功能的CR1－SCR15－18蛋白[6]。本研究用蛋白 CR1－SCR15－18进行肠I/R的保护性实验，观察CR1－SCR15－18能否抑制补体活化，减轻组织损伤。

肠缺血再灌注后补体系统经经典、旁路和甘露聚糖结合凝集素(mannose－binding lectin，MBL)途径不同程度地被激活[5]。C3位于3条激活途径的汇合点，在补体系统激活过程中起着枢纽作用[12]，因此用免疫组化检测缺血再灌注部位的补体组分C3的沉积，能反应补体活化的程度。对比I/R组和SO组免疫组化检测补体C3的结果发现(图1)，I/R组肠黏膜缺血坏死区中有大量补体C3组分的沉积，这说明肠缺血再灌注时，损伤部位补体过度活化，而C3在CR1保护组的沉积明显少于I/R组，说明CR1－SCR15－18蛋白能够有效抑制肠I/R时补体的活化。本研究发现，小肠缺血30 min，再灌注60 min导致严重肠黏膜坏死，脱落，黏膜固有层瘀血水肿，大量炎症细胞浸润，病理损伤严重，反映组织脂质过氧化程度的检测指标MDA含量升高，反映组织超氧阴离子多少的指标SOD活性下降，同时渗透到I/R组肠组织中伊文氏蓝的量和MPO活性的明显增高。而渗透到组织中伊文氏蓝的量间接反映了血管通透性的改变，MPO活性可反映组织中性粒细胞的聚集浸润程度和炎症程度。所以，以上结果说明由补体活化引起的血管通透性改变和中性粒细胞的活化是导致肠I/R损伤的重要原因。补体活化时即可通过C4a、C3a和C5a激活白细胞释放组胺等炎症介质使平滑肌收缩，MAC导致细胞发生渗透性溶解死亡，引起血管通透性的改变，致肠黏膜屏障的破坏[13]。更为严重的是，C3a和C5a能够活化内皮细胞和中性粒细胞，通过上调内皮细胞黏附分子E－选择素、P－选择素等的表达，介导细胞相互作用，从而引起中性粒细胞和单核巨细胞的活化、浸润和聚集[14]，而活化的中性粒细胞可释放大量炎症因子介导肠I/R损伤[2]。因此，可以认为，补体在肠I/R时过度活化是导致肠I/R损伤的重要始动因素。所以，在肠I/R时，用CR1－SCR15－18蛋白抑制补体的活化，能够减少过敏毒素C3a、C5a和MAC的产生，保护血管内皮的完整性，抑制中性粒细胞活化黏附、浸润和聚集，继而减轻组织的炎症损伤。

综上所述，补体活化是导致肠黏膜损伤的重要原因，蛋白CR1－SCR15－18通过抑制补体的活化，减少过敏毒素、MAC和炎症介质的产生，抑制中性细胞和内皮细胞的活化，保护肠黏膜免受损伤。

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