白介素-18促动脉粥样硬化斑块内细胞凋亡的作用

李巧汶 李志樑 邱 健 傅 强 (南方医科大学珠江医院心内科，广东 广州 50282)

目前认为，易损斑块(VP)溃疡、破裂、血栓形成是急性冠脉综合征(ACS)发生的主要病理生理过程。炎症是VP形成的最重要的机制之一，白介素-18(IL-18)作为在炎症反应系统中发挥中心性作用的炎症因子，不但与动脉粥样硬化(AS)斑块的发生、发展〔1，2〕，且参可能与 VP 的形成〔1，3〕，但 IL-18 促 VP 形成的机制尚不清楚。研究表明〔4，5〕，IL-18可诱导多种细胞发生凋亡，而斑块内细胞凋亡是VP的重要特征之一。由此推测IL-18可能通过诱导斑块内细胞凋亡促进VP的形成，但相关的证据缺乏。本研究通过IL-18刺激离体AS斑块，观察斑块内的细胞凋亡指数及形态特征，旨在探索IL-18促进VP形成的可能机制。

1 材料与方法

1.1 动脉粥样硬化模型的制备 30只老年健康雄性新西兰白兔，均为3月龄，平均体重2.2 kg，由广东省医学实验动物中心提供，许可证号0055273。新西兰白兔予适应性喂养1 w后给予高脂饲料(内含1.5%的胆固醇、5%猪油和0.5%的胆盐)10 w，食物和水根据动物的需求供给。10 w后，注射过量的戊巴比妥处死动物。解剖动物，暴露动物的腹主动脉，清除附着于动脉上的脂肪与组织，根据斑块的分布把腹主动脉切割成60个血管块，上述操作严格遵守无菌操作的原则。

1.2 离体标本分组及处理 采用析因设计，给予2种处理因素(4种刺激时间和3种刺激浓度)，以刺激时间和刺激浓度的不同组合作为新处理组，将60个动脉粥样硬化斑块标本随机分入新处理组中(n=5)。把标本孵育在含血清的Ham's F10培养基，实验组除培养基外分别加入250、50 μg/L两种浓度的兔IL-18分别刺激0、1 d、4 d、7 d;对照组孵育在含血清的Ham's F10培养基0、1 d、4 d、7 d。所有标本待培养基颜色变为橙黄色时更换培养基，上述操作严格遵守无菌操作的原则。

1.3 标本大体染色及组织学特点的测量 经上述处理后，甲醛固定标本，常规石蜡包埋、切片，组织HE染色。使用Image-Pro Plus图像分析软件采集分析图像，每个斑块至少取10处测量纤维帽厚度取平均值，测量处包括最厚与最薄处，测量每个斑块纤维帽厚度与脂核横截面厚度的比值。

1.4 斑块细胞凋亡检测 采用原位凋亡试剂盒TUNEL法检测。每张切片随机观察5个高倍视野(×400)，共计数300个细胞，计算TUNEL染色阳性的细胞所占百分比(凋亡指数)。

1.5 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件进行统计分析，用±s表示，析因方差分析多因素各组数据间均数的差异，线性相关分析法分析两个变量间的相关性。

2 结果

2.1 不同IL-18刺激时间和浓度斑块内细胞凋亡指数的变化AS斑块内的细胞凋亡指数随IL-18刺激的时间和浓度的改变而变化(P＜0.01)。随着IL-18刺激时间的延长、刺激浓度的升高，斑块内的细胞凋亡指数有上升趋势(P＜0.01)。见表 1，图 1。

2.2 不同IL-18刺激时间和浓度斑块帽/核比值的变化 AS斑块的帽/核比值随IL-18刺激的时间和浓度的改变而变化(P＜0.01)。随着IL-18刺激时间的延长、刺激浓度的升高，斑块的帽/核比值有下降趋势(P＜0.01)。见表2。

2.3 斑块细胞的凋亡指数与帽/核比值的相关性分析 对斑块细胞的凋亡指数与帽/核比值进行线性相关性分析，结果显示，斑块细胞的凋亡指数与帽/核比值呈显著线性负相关(r=－0.776，P ＜0.001)。

表1 不同IL-18刺激时间和浓度斑块内细胞凋亡指数的变化(±s，析因分析，n=5)

表1 不同IL-18刺激时间和浓度斑块内细胞凋亡指数的变化(±s，析因分析，n=5)

®主效应的F统计量和P值，下表同

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表2 不同IL-18刺激时间和浓度时斑块帽/核比值的变化(±s，析因分析，n=5)

表2 不同IL-18刺激时间和浓度时斑块帽/核比值的变化(±s，析因分析，n=5)

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图1 不同斑块中的凋亡细胞(箭头所示，×400)

3 讨论

ACS是以冠状AS斑块侵蚀或破裂继发的完全或不完全闭塞性血栓形成为病理基础的一组临床综合征，包括不稳定型心绞痛、ST段抬高型心肌梗死、非ST段抬高型心肌梗死。一般认为，引起ACS发生的主要病理生理过程为VP的溃疡、破裂、血栓的形成。炎症反应与VP的形成密切相关，炎症可通过斑块内的炎症细胞及其分泌的促炎症因子使斑块的纤维帽变薄、脂核变大，导致VP表型的形成。IL-18是一种新近发现的在炎症反应中发挥重要作用的促炎症介质，研究表明〔1～3〕，IL-18参与了AS斑块的形成、进展乃至VP形成的整个过程。临床资料也〔6〕显示，ACS患者血浆IL-18的水平显著升高，提示IL-18与VP的发生发展密切相关。然而，IL-18促VP发生发展的机制目前尚不清楚，本研究通过IL-18对离体AS斑块的刺激，观察IL-18对AS斑块内细胞凋亡指数以及AS斑块形态特征的影响，以探索IL-18促VP发生发展的可能机制。

本研究结果显示，AS斑块内的细胞凋亡指数随IL-18刺激的时间和浓度的改变而变化，随着IL-18刺激时间的延长、刺激浓度的升高，斑块内的细胞凋亡指数有上升趋势。AS斑块内细胞凋亡增加可增大斑块内的坏死中心，促使纤维帽变薄，导致VP表型的形成，因此，斑块内细胞凋亡是VP的主要特征之一。本研究结果提示，IL-18可能通过诱导斑块内的细胞凋亡促进VP的形成。IL-18诱导斑块内细胞凋亡的可能途径包括:①IL-18能通过刺激机体释放多种促炎症介质(TNF、IL-1β、IL-6、iNOS)诱导细胞凋亡〔5〕。②IL-18 本身可直接激活外源性凋亡通路和内源性线粒体凋亡通路，诱导细胞凋亡。IL-18一方面可通过诱导TNF的产生、上调NK细胞和Th1细胞的Fas-L表达、增强的Fas-L型介导的细胞毒活性激活外源性凋亡通路〔7，8〕，另一方面，IL-18还可促进线粒体释放细胞色素C从线粒体进入细胞质而激活内源性线粒体凋亡通路〔9〕。

从AS斑块标本的形态特征进行分析，结果表明，AS斑块的帽/核比值随IL-18刺激的时间和浓度的改变而变化，随着IL-18刺激时间的延长、刺激浓度的升高，斑块的帽/核比值有下降趋势，引起斑块趋于VP的形态特征。另外，斑块内细胞的凋亡指数与帽/核比值的线性相关性分析显示，斑块内细胞的凋亡指数与帽/核比值呈显著线性负相关，提示斑块内的凋亡细胞增加促进VP形态特征的形成。斑块内的细胞凋亡增加导致VP形成的可能机制包括:① 细胞凋亡后，一方面可释放胆固醇，使AS斑块核心形成、扩大，损伤纤维帽，另一方面，释放蛋白酶和少量炎性因子，刺激巨噬细胞分泌基质降解蛋白酶，损伤纤维帽，致纤维帽变薄〔10〕，加速VP的形成;②凋亡细胞 (巨噬细胞)被吞噬清除过程中，可诱发炎症反应，促进AS斑块不稳定〔11〕。③巨噬细胞凋亡后，其数目减少，致使凋亡的平滑肌细胞、巨噬细胞等不能被有效吞噬，促进AS斑块内脂质核心形成和扩大，使纤维帽易于破裂;④细胞凋亡后可释放促血栓形成物质 (如组织因子等)〔12〕，促进血栓的形成。

可见，随着随着IL-18刺激时间的延长、刺激浓度的升高，斑块内的细胞凋亡指数有上升趋势，相反，斑块的帽/核比值有下降趋势，而斑块内的细胞凋亡指数和斑块的帽/核比值也呈显著负相关，这就提示了IL-18通过诱导斑块内的细胞凋亡可能是促进VP形成的重要机制。在临床中，检测血浆IL-18的浓度对VP诊断有一定的临床意义，目前，已有不少学者〔13，14〕提出通过检测AS斑块内细胞凋亡以诊断VP;在VP的防治中，抑制IL-18的生物学效应及细胞凋亡将可能成为预防VP形成的重要手段。

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