内皮型一氧化氮合酶G894T基因多态性与冠状动脉病变的关系

李晓明 陈洪军 毛拥军 (青岛大学医学院附属医院，山东 青岛 266003)

冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)是多种遗传因素相互作用所致的多基因疾病，已成为当今世界威胁人类健康的主要疾病之一。其病理基础主要是病变血管管腔狭窄或阻塞导致心肌细胞缺血性损伤。年龄、肥胖、高血脂、吸烟、高血压等传统危险因素已获得较为详尽的研究证据。而基因多态性与冠状动脉病变严重程度的相关性研究也成为国内外研究的热点。本研究应用基因芯片技术对内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因G894T多态性进行分析，探讨青岛地区老年人eNOS基因多态性与冠状动脉病变程度的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择冠心病患者100例，年龄＞60岁，平均(70.28±6.465)岁，均为2011年2月～11月在本院入住并行冠脉血管成像(CTA)检查的患者。入选患者均为窦性心律，心率55～65次/min(心率快者应用倍他乐克控制达标)，节律齐。患者无心力衰竭，肝肾功不全，哮喘等禁忌证。入选病人询问有无高血压、糖尿病、高脂血症病史及冠心病家族史;询问有无吸烟的生活习惯，检测血压、血脂、血糖等。

1.2 方法

1.2.1 多层螺旋CT 全部应用通用电气公司生产的宝石能谱螺旋CT行冠状动脉CTA检查，将患者心率控制在55～65次/min，指导患者静卧并于一次屏气中完成扫描。将扫描图像传递给工作站，由相关工作人员计算冠脉钙化积分(CACS)及图像后续处理。主要选取左冠脉主干(LMA)、左回旋支(LCX)、左前降支(LAD)、右冠状动脉(RCA)进行CACS分析。CACS测定应用国际公认的Agaston积分方法，钙化积分条件为CT值＞130 Hu、钙化面积＞1 mm2，钙化积分为钙化面积与钙化灶CT峰值记分的乘积。其中130～199 Hu为1分，200～299 Hu为2分，300～399 Hu为3分，≥400 Hu为4分。计算出选取的四支冠脉血管各自的钙化积分，相加得出钙化总积分。并按照钙化总积分分为冠状动脉病变低危组(CACS=0～10)，中危组(CACS=11～400)，高危组(CACS＞400)。三组年龄、性别、高血压病史、冠心病家族史比较无统计学差异;主要危险因素(高脂血症病史、糖尿病病史、吸烟史)比较总体差异有统计学意义。见表1。

1.2.2 eNOS基因多态性测定

1.2.2.1 标本制备 抽取受检者肘静脉血2～3 ml，用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，充分混匀。

1.2.2.2 仪器设备 上海百傲科技有限公司提供的BaiO-BE系列基因芯片检测仪，BE-2.0生物芯片识读仪及分子生物实验室常规设备如:离心机TGL-16B，PCR扩增仪TC-25/H，恒温培养箱DHP030，移液器，水溶锅，打印机等。

1.2.2.3 方法步骤 低渗法裂解红细胞，分离白细胞，饱和酚/氯仿法抽提白细胞基因组DNA，加Tirs-EDTA液(TE)溶解DNA，－20℃保存。利用PCR扩增eNOS基因的特异片段，PCR反应体系为25 μl，反应条件为94℃热启动5 min，再94℃变性25 s，56℃退火 25 s，72℃ 延伸 25 s，反复 40 个循环，最后 72℃延伸5 min，进而冷却至4℃。在杂交仓中将基因芯片与PCR扩增产物混匀杂交，加入显色溶液，后置于BaiO基因生物芯片识读仪上检测，图像Array Doctor软件分析可自动生成检测结果，最后检测出eNOS基因多态性位点。

1.3 统计学分析 应用SPSS15.0统计软件，基因型及等位基因频率采用直接计数法，比较应用χ2检验。组间人群基因分布应用χ2检验是否符合Hardy-Weinberg平衡，以P＞0.05表明样本具有群体代表性。计量资料均采用±s表示，组间均数比较应用t检验，采用多因素多分类Logistic回归分析，应用多元线性回归分析多个影响冠脉病变因素与CACS之间的线性数量关系。

2 结果

三组等位基因、基因型分布进行基因多态性遗传平衡检验，两组间基因型分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律(P＞0.05)，表明样本具有群体代表性。

2.1 三组eNOS基因G894T突变位点基因型及等位基因分布

低危组31例研究对象中GG基因型29例(93.5%)，GT基因型2例(6.5%)，TT基因型0例;G等位基因频率96.8%，T等位基因频率3.2%;中危组38例研究对象中GG基因型32例(84.2%)，GT基因型5例，TT基因型1例，GT+TT基因型占15.8%，G等位基因频率90.8%，T等位基因频率9.2%;高危组31例研究对象中GG基因型14例(45.2%)，GT基因型14例，TT基因型3例，GT+TT基因型占54.8%，G等位基因频率67.7%，T等位基因频率32.3%。经χ2检验得出高危组GT+TT基因型、T等位基因明显高于低、中危组，差异有统计学意义(χ2=21.907、20.173，P=0.000)。见表 2。

表1 三组一般临床资料比较(n)

表2 eNOS基因G894T突变位点的基因型及等位基因频率分布〔n(%)〕

2.2 多因素多分类Logistic回归分析 将CACS低、中、高危组作为因变量，eNOS基因G894T多态性、年龄、性别、是否有高血压病史、糖尿病史、冠心病家族史、高脂血症病史、吸烟史等作为自变量，进行Logistic回归分析。结果显示:似然比检验说明整个模型检验具有显著意义(P=0.002)。eNOS基因G894T多态性和是否吸烟对CACS有影响(P=0.001，P=0.043)。年龄，性别，高血压病史，冠心病家族史，糖尿病史，高脂血症病史无影响(P＞0.05)。拟合优度检验示 P=0.316，P=0.357，可见Pearson法和Deviance法均显示拟合效果良好。参数估计以各变量的最高水平为基线类，CACS分组以高危组为基线类，吸烟史以1=“有吸烟史”为基线类，eNOS基因多态性以1=“GT+TT基因型”为基线类。以“年龄＞80岁、性别=男、高血压、糖尿病、高脂血症病史、冠心病家族史、吸烟史”为基线类。OR值表示关于基线类的优势:在低危组、中危组中eNOS基因G894T突变位点为GG基因型的倾向分别是高危组的13.154倍、5.487倍。低、中危组无吸烟史的倾向分别是高危组的5.759倍、5.493倍。说明eNOS的GT+TT基因型及有吸烟史是CACS高的危险因素。见表3。

2.3 多元线性回归分析 见表4，表5，图1。将CACS分值作为因变量，将eNOS基因G894T多态性、年龄、性别、是否有高血压病史、糖尿病史、冠心病家族史、高脂血症病史、吸烟史等作为自变量，进行多元线性回归分析。全变量回归分析，对方程检验，F=8.746，P=0.000，有统计学意义。参数估计如下，由标准化回归系数可见，8个自变量对因变量CACS值的影响从大到小依次为eNOS基因型、吸烟史、高脂血症病史、冠心病家族史、糖尿病史、年龄、高血压病史、性别。一般回归方程为:CACS值 =－110.823+270.325eNOS基因 G894T多态性 +114.255吸烟史(有)+113.991高脂血症病史(有)+86.572冠心病家族史(有)+63.169糖尿病史(有)+2.573年龄 －23.647高血压病史(有)－14.241性别(男)。对方程内各自变量单独检验，自变量“eNOS基因型、吸烟史、高脂血症病史”对因变量有显著影响，P值分别为0.000，0.038，0.017。逐步回归分析示，对方程检验，F=21.163，P=0.000，有统计学意义。参数估计如下，由标准化回归系数可见，影响CACS的自变量从大到小依次为eNOS基因型、高脂血症病史、吸烟史。回归方程为:CACS值 =94.631+300.439eNOS基因 G894T多态性 +123.803高脂血症病史(有)+107.309吸烟史(有)。P-P概率图可直观推断本数据服从正态分布。

表3 多分类Logistic回归分析

表4 多元线性回归(全变量回归分析)

表5 多元线性回归(逐步回归分析)

图1 P-P正态概率累积概率图

3 讨论

自Tanenhaum〔1〕首次报道用超高速CT检测冠状动脉钙化间接推断冠心病以来，高速CT临床应用的研发逐渐增多。目前，新一代的多层螺旋CT在心脏扫描方面有突破性进展，由于整合了心电门控、螺旋CT可利用数字化式心电图仪来跟踪心动周期，并把心电图波纹以模拟信号的形式转换为数字信号传递给CT机，使门控CT的螺距、床速以及球管旋转速度调整到与病人心率一致，并抓住心肌舒张R-R间期的80%时间段触发及完成扫描。虽然冠脉造影一直是诊断冠状动脉病变的金标准，但作为有创检查，它有一定的操作并发症，并且不能用于碘过敏试验阳性的患者，适应性较窄。64层螺旋CT冠状动脉成像是目前有效可靠的冠心病诊断方法之一，能准确地显示冠状动脉病变，其敏感度为97% ～99%，特异度约83% ～94%〔2〕。国内已有人对150例行64层螺旋CT冠状动脉成像的患者进行回顾性分析，定量评价CACS与冠状动脉狭窄的关系，结论为CACS可反映冠状动脉病变的程度及范围，对患者冠脉狭窄有较高的诊断准确性〔3〕。将来冠状动脉CTA这种无创简便的检查方法有望替代诊断性冠状动脉造影。

目前国内外已发现多种基因多态性与冠脉病变发生的危险增加密切相关，但各家报道不一致，至今尚未确认出冠状动脉病变的相关基因。NOS通过精氨酸-NOS-瓜氨酸途经合成一氧化氮(NO)，是该途径中惟一的限速酶，是决定血管壁NO基础水平的关键酶。已报道的人类NOS基因分3型，即eNOS、神经元型(nNOS)和诱生型(iNOS)。其中，eNOS主要存在于全身各级动脉血管壁内皮细胞、血小板、心内膜和心肌细胞内;eNOS基因编码位于染色体7q35-36区，由26个外显子和25个内含子组成，长度21 kb，主要在内皮细胞表达，系钙调素依赖性。在心血管系统中，NO具有扩张血管、抑制血小板黏附与聚集、抑制平滑肌细胞增殖等重要生理功能。eNOS是心血管系统中合成NO的主要酶，在冠心病的发病中具有重要作用。动物实验研究表明，敲除eNOS基因的小鼠易患动脉粥样硬化，导致冠心病的发生。抑制NOS可加速早期动脉粥样硬化斑块的形成〔4〕。eNOS基因第7外显子第78位碱基即编码序列第894位碱基发生G→T突变(G 894 T)，导致第298位氨基酸残基发生谷氨酸被天门冬氨酸代替(Glu 298 Asp)。Rossi、Colombo分别在高加索地区人群及意大利人群中进行病例对照研究〔5，6〕，表明Glu 298 Asp变异与冠心病及急性心肌梗死的发生显著相关;但也有研究显示，该变异与冠心病的发病无相关关系〔7〕。目前国内研究eNOS基因较少，而且结论多不一致。由于人种差异，国外的eNOS基因多态性研究对中国人可能不适用。

本研究发现冠状动脉病变高危组人群eNOS基因的GT+TT基因型频率高于低、中危组，且TT基因型仅存在于中、高危组，提示GT、TT基因型、T等位基因与冠状动脉病变的发生可能相关。冠脉病变的发生可能与eNOS基因G894T多态性有关，这种突变可能与冠脉病变的传统危险因素如吸烟史、高血脂、高血糖有密切联系。进一步的多分类Logistic回归分析显示eNOS基因GT+TT型、吸烟是冠状动脉病变的独立危险因素。将CACS作为因变量作多元线性回归分析示，eNOS基因GT+TT型、吸烟、高脂血症病史是影响CACS的主要因素，其中影响最大的为eNOS基因G894T多态性。研究发现吸烟与eNOS基因G894T多态性既作为独立危险因素也互相作用影响冠状动脉病变，高血脂也与eNOS基因G894T多态性、吸烟共同参与冠状动脉病变的发生，但非独立危险因素。本实验由于样本量等其他因素限制不能完全明确冠脉病变的影响因素，冠状动脉病变作为一类受遗传和环境共同影响的复杂疾病，特别是遗传因素需要更进一步的大样本流行病学研究。

1 Tanenbaum SR，kondos GT，Veselik KE，et al.Detection of calcific deposits in coronary arteries by ultrafast computed tomography and correlation with angiography〔J〕.Am J Cardiol，1989;63(12):870-2.

2 Mowatt G，Cook JA，Hillis GS，et al.64-Slice computed tomography angiography in the diagnosis and assessment of coronary artery disease:systematic review and meta-analysis〔J〕.Heart，2008;94(11):1386-93.

3 鲁锦国，吕 宾，戴汝平，等.64层螺旋CT冠脉钙化积分的再认识〔J〕. 放射学实践，2009;24(8):854-7.

4 Cayatte A，Palacino JJ，Horten K，et al.Chronic inhibition of nitric oxide production accelerates neointima formation and impairs endothelial func-tion in hypercholesterolemic rabbits〔J〕.Arterioscler Thromb，1994;14(5):753-9.

5 Rossi GP，Cesari M，Zachetta M，et al.The T-786C endothelial，nitric oxide synthase genotype is a novel risk factor for coronary artery disease in Caucasian patients of the GENICA study〔J〕.J Am Colil Cardiol，2003;41(6):930-7.

6 Colombo MG，Paradossi U，Andreassi MG，et al.Endothelial nitric oxide synthase gene polymorphisms and risk of coronary artery disease〔J〕.Clin Chem，2003;49(3):389-95.

7 Wang CL，Hsu LA，Ko YS，et al.Lack of association between the Glu298Asp variant of the endothelial nitric oxide synthase gene and the risk of coronary artery disease among Taiwanese〔J〕.J Formos Med Assoc，2001;100(11):736-40.