载脂蛋白E基因多态性与原发性高血压伴周围动脉硬化闭塞症的关系

刘建伟 叶 玲 刘 静 李小鹰 (解放军总医院老年医学研究所，北京 100853)

有研究证实，高血压、糖尿病、动脉粥样硬化和吸烟等为周围动脉硬化闭塞症(peripheral arterial occlusive disease，PAOD)的主要危险因素〔1〕，载脂蛋白E(ApoE)参与调节机体脂质代谢，其基因多态性与动脉粥样硬化有关〔2〕。本研究采用多重四引物扩增受阻突变体系PCR法(multiplex tetra-primer amplification refractory mutation system polymerase chain reaction，multiplex T-ARMS PCR〔3〕)，对北京市万寿路社区健康老年人、老年原发性高血压(essential hypertension，EH)、老年周围动脉硬化闭塞症(PAOD)和老年EH伴PAOD病例中ApoE基因多态性进行分析，探讨这一基因变异与EH和PAOD的关系，以期阐明遗传易感因素在其发病机制中的作用。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选自“2002年北京市万寿路社区老年周围动脉硬化闭塞症流行病学调查”人群(2 124例)。健康老年人(NC组)100例，汉族，男50例，女50例，年龄60～81〔平均(66.3±4.4)〕岁;老年EH组100例，汉族，男50例，女50例，年龄60～82〔(平均67.2±4.2)〕岁;老年 PAOD组83例，汉族，男28例，女55例，年龄60～86〔平均(69.3±3.7)〕岁;老年EH伴PAOD组59例，汉族，男17例，女42例，年龄60～85〔平均(70.2±3.0)〕岁。

筛选标准:NC组为经病史、体格检查、心电图及实验室检查排除了冠心病(参照1979年WHO颁布的诊断标准)、糖尿病(参照1997年ADA颁布的诊断标准)、高血压(参照1999年中国高血压防治指南颁布的诊断标准)以及PAOD等心脑血管疾病的健康人群。EH组诊断标准参见NC组，排除继发性高血压、冠心病、糖尿病以及PAOD，收缩压(SBP)≥140 mmHg和(或)舒张压(DBP)≥90 mmHg。PAOD组诊断标准参照文献〔4〕，排除高血压、冠心病和糖尿病。EH+PAOD组诊断标准参见EH和PAOD组，排除继发性高血压。

1.2 研究方法 经典酚-氯仿抽提法提取全血DNA。采用multiplex T-ARMS PCR法检测ApoE基因型，引物参照文献设计〔3〕，由上海英骏生物工程技术服务有限公司合成，序列为:FO:5'-ACTGACCCCGGTGGCGGAGGA-3';RO:5'-CAGGCGTATCTGCTGGGCCTGCTC-3';FI-1:5'-GGCGCGGACATGGAGGACGgGC-3';RI-1:5'-GCGGTACTGCACCAGGCGGCCtCA-3';FI-2:5'-CGATGCCGATGACCTGCAGA c GC-3';RI-2:5'-CCCGGCCTGGTACACTGCCAG t CA-3'。其中FI-1和 RI-1分别用于检测ApoE基因第112位精氨酸(Arg112)密码子cGC的C和第112位半胱氨酸(Cys112)密码子tGC的T，扩增片段长度为:FI-1/RO 444 bp和FO/RI-1 115 bp;FI-2和RI-2分别用于检测ApoE基因第158位精氨酸(Arg158)密码子cGC的C和第158位半胱氨酸(Cys158)密码子tGC的T，扩增片段长度为:FI-2/RO 307 bp和FO/RI-2 253 bp。为了监控反应体系的有效性，以FO/RO为内参照系统，扩增片段长度为514 bp。PCR扩增条件:反应体系 20 μl，95℃ 预变性 15 min 后，95℃ 30 s，66℃30 s，72℃ 30 s，共35 个循环，最后于 72℃再延伸 7 min。PCR扩增仪为Biometra Tgradient，TaKaRa Ex Taq HS DNA聚合酶为大连宝生物工程有限公司产品。反应完成后，2%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，以DL2000 DNA分子量标准物为参考判定PCR结果。对所有受检者同时进行血脂、血糖、血压、血浆纤维蛋白原(FIB)、体重指数(BMI)及听觉诱发电位指数(AAI)等的检测。

1.3 统计学处理 使用SPSS13.0统计软件进行处理，计量资料以±s表示，基因频率采用基因计数法，基因型及基因频率比较采用χ2检验。

2 结果

2.1 一般情况比较 PAOD组和EH+PAOD组AAI值显著低于NC组和EH组(P＜0.05);EH+PAOD组和EH组SBP显著高于NC组(P＜0.05);其余指标(血脂、血糖、FIB、BMI)的水平，三组间无显著性差异。见表1。

2.2 ApoE六种基因型频率及三种等位基因频率的比较 内参照基因514 bp条带清晰，检测样品均成功扩增出目的条带。共检测出6种基因型，每一个纯合子有两个不同长度的片段。ε2/2基因型显示253 bp(Cys158)和115 bp(Cys112)条带，ε3/3基因型显示307 bp(Arg158)和115 bp(Cys112)条带，ε4/4基因型显示444 bp(Arg112)和307 bp(Arg158)条带。杂合子ε4/2基因型扩增出4个条带，其他两个杂合子各扩增出3个条带，ε3/2扩增出除444 bp以外的条带，ε4/3扩增出除253 bp以外的条带。NC组、EH组、PAOD组和EH+PAOD组ApoE各基因型频率及等位基因频率分布均无显著性差异(P＞0.05)。见表2，图1。

表1 NC、EH、PAOD与EH+PAOD组一般情况比较(±s)

表1 NC、EH、PAOD与EH+PAOD组一般情况比较(±s)

与NC组比较:1)P＜0.05;与EH组比较:2)P＜0.05;与PAOD组比较:3)P＜0.05

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表2 NC、EH、PAOD与EH+PAOD组ApoE各基因型频率及等位基因频率分布〔n(%)〕

图1 ApoE等位基因Multi-ASP-PCR图谱

3 讨论

ApoE是由299个氨基酸组成的糖蛋白，分子量34.2 kD，主要存在于血浆乳糜微粒、极低密度脂蛋白和高密度脂蛋白中。ApoE作为ApoE受体与低密度脂蛋白(LDL)受体的配基，能高亲和性地与这两种受体结合，是调节机体脂质代谢的重要因素。Utermann等〔5〕的研究表明，ApoE基因位于第19号染色体上，该基因第4外显子内编码第112位氨基酸及第158位氨基酸的密码子具有多态性，可产生三种常见的等位基因:ε4、ε3和ε2，分别编码 Apo E 的三种主要异构体 ε2、ε3和 ε4，其中 ε3是人群中最常见的一种异构，故常称为野生型，而ε2、ε4称为变异型，从而形成6 种不同表型:3 种纯合子(ε2/2、ε3/3、ε4/4)和3种杂合子(ε2/3、ε3/4、ε2/4)。携带不同 ApoE 基因型的个体其血脂水平有差异，从而影响与血脂水平相关疾病的发病率〔6〕。在不同国家和地区人群中ApoE 6种基因型的分布不均匀，有明显的共同特点，即:ε3/3型发生频率最高;含ε3等位基因的杂合子(ε4/3，ε3/2)次之;ε2/2、ε4/4、ε4/2 的发生频率最低。本研究结果显示:在北京市社区老年人群中，老年健康对照组 ApoE 基因型频率分别为 ε3/3，72.0%;ε4/3，12.0%;ε3/2，14.0%;ε2/2，0%;ε4/4，0%;ε4/2，2.0%;ε4 等位基因频率为7.0%，符合上述规律。与马凤等〔7〕报告的2 000例中国农村地区65岁及以上老年人群ApoE基因型频率及ε4等位基因频率分布 (ε3/3，68.8%;ε4/3，13.3%;ε3/2，13.6%;ε2/2，1.1%;ε4/4，1.2%;ε4/2，2.0%;ε4，8.8%)相近。ε4 等位基因频率亦接近于香港的7.4%;略高于台湾的4.9%和新加坡的6.4%;低于大多数欧洲及北美人群。

PAOD和EH的共同病理基础主要是动脉粥样硬化。李小鹰等〔8〕对北京社区2 124例60岁及60岁以上老年人的流行病学调查资料表明，PAOD在北京地区老年人群中的现患率为15.91%;在老年血脂异常患者中为17.18%;在老年血脂异常合并高血压患者中为19.18%;在老年血脂异常合并糖尿病患者中为19.48%;在高龄血脂异常患者中为42.86%;高龄血脂异常患者PAOD的现患率是普通老年患者的2～3倍。由此说明导致PAOD病理改变的因素中血脂异常与高龄起了关键的作用，高血压、糖尿病亦是促进PAOD病理改变的不容忽视的因素。PAOD、高血压均为老年常见病，其发生发展与吸烟、饮酒、高盐高脂饮食、肥胖、精神紧张和情绪变化等多种外界因素相关，遗传因素在其发病中也起着重要作用〔4〕。ApoE是调节机体脂质代谢的重要因素，有关ApoE基因多态性与PAOD的易感性研究在国内外尚未见报道。为了避免因病例选择造成的偏倚，本研究选择的病例及对照组均为中国北方汉族人、居住同一社区、无血脂异常、继发性高血压、糖尿病、血管梗死性疾病，尽可能减少这些因素的影响。本研究通过对EH、PAOD、EH+PAOD老年病例组与NC组ApoE基因多态性的分析发现，尽管ε4等位基因频率三个病例组均高于NC组，ε3和ε2等位基因频率均低于NC组，但是无统计学意义。从而表明，在本研究人群中，ApoE等位基因ε4、ε3和ε2多态性不是老年EH和老年PAOD的独立危险因素，可能与血脂正常的老年EH和老年PAOD发生无关，即血脂正常的老年人群中EH与PAOD的发生还有其他影响因素的参与。Yilmaz等〔9〕报道ApoE等位基因ε4与EH相关，与本研究结论不一致，可能与其病例组的选择不都是血脂正常的老年人有关。总之，进一步研究遗传易感因素在老年EH和老年PAOD发病中的贡献，有助于减少该病在老年人群中的发病率改善人们的生活质量。

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2 Reilly SL，Ferrell RE，Kottke BA，et al.The gender-specific apolipoprotein E genotype influence on the distribution of lipids and apolipoproteins in the population of Rochester，MN.I.Pleiotropic effects on means and variances〔J〕.Am J Hum Genet，1991;49(6):1155-66.

3 Yang YG，Kim JY，Park S，et al.Apolipoprotein E genotyping by multiplex tetra-primer amplification refractory mutation system PCR in single reaction tube〔J〕.J Biotechnol，2007;131(2):106-10.

4 Smith FB，Lee AJ，Rumley A，et al.Tissue-plasminogen activator，plasminogen activator inhibitor and risk of peripheral arterial disease〔J〕.Atherosclerosis，1995;115(1):35-43.

5 Utermann G，Vogenberg KH，Steinmetz A，et al.Polymorphism of apolipoprotein E genetics of hyperlipoprotypeinemia type Ⅲ〔J〕.Clin Genet，1979;15(1):37-62.

6 Rastas S，Mattila K，Verkkoniemi A，et al.Association of apolipoprotein E genotypes，blood pressure，blood lipids and ECG abnormalities in a general population aged 85〔J〕.BMC Gefiatr，2004;4:1.

7 马 凤，梁超轲，程义斌，等.中国农村老年人群APOE基因型频率分布研究〔J〕.环境与健康杂志，2008;25(8):662-4.

8 李小鹰，王 洁，王全义，等.周围动脉硬化闭塞症在老年血脂异常人群中的现患率调查〔J〕.中华老年心脑血管病杂志，2005;7(1):3-6.

9 Yilmaz H，Isbir T，Agachan B，et al.Is epsilon 4 allele of apolipoprotein E associated with more severe end-organ damage in essential hypertension〔J〕.Cell Biochem Funct，2001;19(3):191-5.