草菇培养料中微生物总DNA的高效提取1)

侯立娟 李玉 孟丽(吉林农业大学，长春，130118)John A.Buswell陈明杰(上海市农业科学院食用菌研究所)宋金俤(江苏省农业科学院蔬菜研究所)

草菇(Volvariella volvacea(Bull.:Fr)Sing.)具有较高的营养价值、药用价值、商业价值和生产价值，现已发展成为世界性栽培的食用菌之一，其产量位居世界食用菌产量的第10位。1970年以前，草菇的栽培主要以稻草生料为主，自1971年，张树庭教授采用经二次发酵的废棉栽培草菇，提高了其产量［1］。培养料在自然发酵过程中微生物区系发生了改变，但是，有关微生物的动态变化尚未见报道。DNA的PCR扩增是研究分子生物学的基本方法，提取的DNA纯度和产量对后续试验的开展至关重要，对于同一批次的培养料采用不同DNA提取方法或是不同批次培养料采用同一种提取方法其产量和质量都存在较大差异。由于草菇培养料中，腐殖酸含量较高，是土壤样品的10～100倍［2］，而且还含有大量的有机质、多糖、棉酚、微生物的代谢产物以及一些杂质，其环境样品的组成较为复杂，因此，DNA的提取方法具有重要意义。本研究通过6种DNA提取方法的比较，旨在筛选出一种或几种有效提取栽培前、栽培后培养料总DNA的方法，为研究其微生物的组成奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

栽培草菇的培养料，其主要成分为废棉(95%)、石灰(5%)，含水量(65±2.8)%，pH值(9.0±0.5)。采集地为上海浦东新区的上海食用菌所高桥基地。采用5点法取样，混匀，用灭菌的聚丙烯袋收集样品，-30℃保存。

1.2 提取草菇培养料中总DNA方法

采用6种方法对草菇培养料总DNA进行提取，除试剂盒提取所用样品为0.020 0 g外，其余方法均为0.200 0 g，用液氮研磨，-30℃保存备用。具体提取方法为:①化学裂解与酶裂解相结合法。用4 mL的磷酸缓冲液洗涤样品3次［3］，去除胞外DNA和可溶性的有机物质。参见文献［4］进行DNA的提取。为减少机械损伤，采用酶解法(细胞裂解液中含2.5 g/L溶菌酶，25 g/L溶壁酶)取代beadmill法。酶解结束后，加入150μL 20%的SDS，0.15 g PVPP，65℃水浴1.5 h。采用PEG28000(最终质量分数为10%的PEG，1.1 mol/L的NaCl)进行DNA的沉淀，4℃静置2 h以上，16 000 r/min离心15 min，即可获得核酸沉淀。②氯化苄法。参照朱衡等［5］的方法。在样品中加1 mL提取液(100 mmol/L Tris HCl，pH值9.0;0.040 mmol/L EDTA，pH值8.0)，充分混匀，加0.1 mL 10%SDS，0.3 mL氯化苄，剧烈振荡成乳状，在50℃条件下温浴1 h，间隔10 min混匀一次，加0.3 mL 3 mol/L NaAC(pH值5.2)混匀，然后冰浴15 min，4℃，6000 r/min离心15 min，取上清液，加等体积异丙醇室温沉淀20 min，室温，1 000 r/min离心15 min，沉淀用70%乙醇洗2次，吸干后溶于TE，测OD值，保存于-20℃。③CTAB法。采用植物基因组DNA提取的CTAB法［6］。将样品加入65℃预热的2×CTAB抽提液，65℃保温45 min以上，间或轻摇混匀;室温，12000r/min离心20min。取上清液，加入与之等体积的氯仿—异戊醇混合溶液(V(氯仿)∶V(异戊醇)=24∶1)，轻轻混匀15 min以上，室温，12000 r/min离心20 min，取上清液移入新离心管中;加入2/3体积的-20℃预冷的异丙醇，轻轻摇动5 min，室温，8 000 r/min离心10 min，去上清;沉淀用75%乙醇10 mmol/L KAC抽提2～3次，每次8 000 r/min室温离心10 min;加入预冷的95%乙醇，轻轻上下颠倒，室温，12 000 r/min离心20 min，弃乙醇，真空抽干或自然晾干;加入200μL TE buffer，轻轻敲打使沉淀溶解;加入1μL 10 g/L RNAase，37℃水浴，保温1 h，去除RNA;DNA提取物于冰箱中-20℃贮藏备用。④改良CTAB法。在CTAB法的基础上，稍作改良［7］，该方法在上海市农业科学院实验室广泛应用于各种真菌菌丝的提取。将样品加入65℃预热的2×CTAB抽提液，65℃保温60 min，间或轻摇混匀;12 000 r/min室温离心10 min;取上清液，加入与之等体积的酚—氯仿混合溶液(V(酚)∶V(氯仿)=1∶1)，混匀1 min，4℃、12 000 r/min离心10 min，上清液中加入与之等体积的氯仿—异戊醇混合溶液(V(氯仿)∶V(异戊醇)=24∶1)，轻轻混匀1 min，4℃、12 000 r/min离心10 min，取上清液移入新离心管中;加入0.1倍体积的-20℃预冷3 mol/L NaAC，等体积的异丙醇，-30℃放 置30 min，4℃ 12 000 r/min离 心10 min，在沉淀中加入沉淀用70%乙醇1 mL洗涤2～3次，4℃、12 000 r/min离心10 min，弃乙醇，真空抽干或自然晾干;加入100μL TE buffer，轻轻敲打使沉淀溶解;加入1μL 10 g/L RNAase，4℃水浴1 h，去除RNA;DNA提取物于冰箱中-20℃贮藏备用。⑤MP土壤试剂盒提取法(MP Biomedicals，Solon，OH，USA)。提取方法参见试剂盒说明书。⑥新型植物基因组DNA试剂盒提取法(天根生物技术，北京，中国)。参见试剂盒说明书提取。

1.3 DNA的质量检测

6种提取方法的总DNA经0.1%琼脂糖凝胶电泳，用5 μL的总DNA和1μL的6×loading buffer点样，用λDNA做为Marker。EB染色并用EC3 Imaging System凝胶成像系统拍照记录结果。DNA浓度仪测定DNA的A260/A280、A260/A230。

1.4 纯化粗DNA

将6种方法提取得到的DNA溶液按照上海申能博彩3SDNAPurification Kit说明书过柱纯化。

1.5 聚合酶链式反应扩增微生物DNA

将各个方法纯化后的DNA作为模板，稀释到50 mg/L。为检测提取的总DNA样品对PCR扩增的影响，分别用真菌、细菌、放线菌特异性引物进行PCR扩增。反应体系25μL，包括10×Taq Reaction Buffer 2.5μL，Mg2+(25 mol/mL)2μL，dNTP(10 mol/mL)0.5μL，5'引物(25 mol/L)0.5μL，3'引物(25 mol/mL)0.5μL，模板DNA(50 mg/L)0.5μL，DNA Taq聚合酶(5 U/μL，BBI，China)0.5μL，蒸馏水18μL。引物序列及反应条件见表1。

2 结果与分析

2.1 草菇培养料中总DNA提取方法的差异

用6种方法提取草菇培养料中总DNA，电泳结果如图1所示。由图1可见，电泳条带清晰，整洁，DNA的分子量大约在40 kB左右，不会对后续操作产生影响，各方法提取DNA条带的亮度存在差异，其中用植物试剂盒提取的DNA条带亮度不及其他处理，这可能是由于样品量的原因。植物试剂盒提取按照说明书的用量为0.020 0 g。

图1 不同方法提取的草菇培养料中总DNA琼脂糖浆电泳图

2.2 不同提取方法DNA产量和质量

各个方法提取的DNA产量存在一定的差异(表2)。由表2可见，化学裂解与酶裂解相结合法提取的DNA产量最高，植物试剂盒提取法的产量最低，分别为(2 372.72±28.85)μg/g和(87.67±2.04)μg/g。化学裂解与酶裂解相结合法比氯化苄法、CTAB法、改良CTAB法、MP土壤试剂盒提取法、植物试剂盒提取法分别提高2.3、6.1、13.5、13.4、25.9倍。除氯化苄法提取的DNA颜色为深棕色，纯化后为黄棕色外，其余5种方法提取的DNA的颜色均呈白色，经过纯化后无色透明。各个方法的A260/A280及A260/A230的比值也存在差异，但是除了氯化苄法外，其余方法A260/A280的比值均达到或接近1.8，A260/A230比值达到或超过2(数据未列出)，说明纯化效果比较明显。从各方法的变异系数来看，化学裂解与酶裂解相结合法和MP土壤试剂盒提取法的变异系数较小。

2.3 各方法提取总DNA稀释到50 mg/L扩增微生物结果

分别用4种真菌、3种细菌和1种放线菌的特异性引物进行微生物扩增。扩增结果见图2。由图2可见，各方法提取的DNA用于扩增微生物，其结果主要区别在于目的条带的有无，目的条带的多少，以及目的条带亮度的强弱。对于真菌的18 S区域，与其他方法相比，MP土壤试剂盒和植物试剂盒有微弱的目的条带，其他方法均未扩增出目的条带;对于真菌的28 S区域，除了氯化苄法外，其余的方法均能扩增出370 bp目的条带;对于真菌的ITS3-4区域和ITS1-4区域，除了氯化苄方法外，其余方法均能扩增出公共目的条带，并且化学裂解与酶裂解相结合法和MP土壤试剂盒提取的DNA扩增出的目的条带多。扩增3种细菌和1种放线菌的结果与扩增真菌的结果相同，除了氯化苄法外，其余方法均能扩增出公共目的条带，而且化学裂解与酶裂解相结合法、MP土壤试剂盒和植物试剂盒提取的DNA比其余方法扩增出的目的条带多。因此，除了氯化苄方法外，其余方法均能同时有效地提取细菌、真菌和放线菌总DNA，说明其质量满足PCR扩增要求。

表1 真菌、细菌、放线菌引物序列及反应条件

表2 各方法提取草菇培养料DNA的产量和质量

图2 各方法提取的草菇培养料DNA稀释到50 mg/L PCR扩增微生物的电泳结果

2.4 不同方法提取时间、费用成本的差异

由表3可见，MP土壤试剂盒提取法和植物试剂盒提取法提取时间相对较短，不到1 h，化学裂解与酶裂解相结合法所用的提取时间最长，为7 h。从花费的成本来看，MP土壤试剂盒提取法需要73.28元，其次是化学裂解与酶裂解相结合法，氯化苄法的成本最少，为0.05元。

表3 不同提取方法提取草菇培养料中总DNA所需时间及费用成本

3 结束语

基于DNA分析的分子技术，解决与培养方法有关的问题，说明环境样品微生物种群的多样性及微生物种群结构［15-16］，据报道检测双孢菇在堆肥过程中微生物群落的分子技术存在差异［17］，因此，DNA提取是研究分子生物学的基本技术，本研究采用包括2种试剂盒提取在内的6种定量提取方法，从产量、质量、扩增微生物、所用时间及成本5个方面综合比较了6种提取培养料DNA的方法，结果表明:①最有效地提取培养料中DNA的是化学裂解和酶裂解相结合法。此方法包括加入PVPP的高盐裂解液结合PEG—8000沉淀DNA，SDS裂解、生物酶(溶菌酶、溶壁酶及蛋白酶K)进行细胞破壁，减少腐殖酸的污染［18-19］，能够减少如玻璃珠的机械损伤，减少PCR扩增的断裂小片段［20-21］。②氯化苄法提取的DNA产量不低，但纯度不够，纯化后不能扩增出目的条带。提取的DNA深棕色，推测为CTAB、SDS、酚类、异丙醇等物质严重干扰扩增结果［22］，此方法不适于草菇培养料DNA的提取。③除氯化苄方法外，其余5种方法经过3S柱纯化后的A260/A280值达或接近到1.8和2.0，都适合PCR扩增，表明纯化效果显著。提取培养料总DNA是借鉴从土壤或沉淀中提取DNA的方法［18，23-24］。④从提取DNA的时间进行评价，化学裂解和酶裂解相结合法所用的时间最长，试剂盒提取的时间短。⑤从成本上比较，以进口的试剂盒费用昂贵，MP土壤试剂盒提一个样品需要73.28元，其次是化学裂解和酶裂解相结合法，氯化苄法所用的试剂相对便宜但扩增效果不佳。

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