LAMP（环介导等温扩增）的原理及在寄生虫检测上的应用＊

史亚东，赵子方，朱 丹，张龙现，宁长申，菅复春

LAMP（环介导等温扩增）的原理及在寄生虫检测上的应用＊

史亚东，赵子方，朱 丹，张龙现，宁长申，菅复春

2000年，Notomi等［1］建立了一种快速、简单、灵敏、特异并且低成本的核酸扩增方法——环介导等温扩增法（LAMP），这种新颖的核酸扩增方法具有许多优势［2－4］：（1）扩增效率极高，60min内扩增产物可达到靶基因的109～1010倍；（2）操作简单，只需在65℃左右的恒温条件下将反应物混合即可，不需要复杂的温度变化过程；（3）灵敏性高，扩增模板只需10拷贝或更少；（4）特异性高，设计4条引物识别靶基因上6个不同区域；（5）结果判定简单，可以通过反应副产物直接肉眼观察，也可以通过浊度仪实时监控，无需电泳。LAMP方法的这些优势，使其短时间内在病毒、微生物、寄生虫等检测上广泛应用。以下就LAMP方法的原理及在寄生虫检测上的应用，简述如下。

1 LAMP原理［1，5］

1.1 引物 LAMP方法需要根据靶基因设计两对特殊引物，分别是内引物FIP和BIP、外引物F3和B3。它们特异识别靶基因的6个不同区域：3′端的F3c、F2c、F1c和5′端的B1、B2、B3。FIP由F2（与F2c互补）和F1c构成；BIP由B2（与B2c互补）和B1c构成，如图1。

图1 LAMP的引物组成及对应区域

LAMP方法的引物设计较为复杂，但有专门软件可以设计LAMP引物，这使LAMP方法变的很易操作，Eiken GENOME SITE网站（http：//primerexplorer.jp/e/）专门开发了 LAMP引物设计软件，研究者可以通过该软件获得精准的LAMP引物。

1.2 循环过程 在65℃左右时，DNA双链处于解链和聚合的动态平衡中，一个LAMP引物可以和靶基因链的一端互补结合，然后开始利用DNA聚合酶通过链置换作用合成DNA，置换并释放出一条单链DNA，这不像PCR方法那样需要通过热变性来得到单链DNA。下面就从FIP释放单链DNA开始说明LAMP的扩增机制。

通过链置换作用，DNA聚合酶从FIP上F2的3＇端开始合成一条和靶基因链互补的DNA链。接着，F3和F3c区域互补结合，在靶基因链通过DNA聚合酶合成DNA，并置换出FIP结合的互补链。F3依照靶基因链合成一个互补链，这样就形成了一个双链DNA。F3引物合成新DNA链并把原来的DNA链置换出，这样FIP结合的互补链就被释放。然后，因为F1c区域和F1区域互补，被释放的单链DNA就在其5＇端形成一个茎环结构。上面形成的单链DNA作为一个模板用于BIP启动DNA合成，也用于后来的B3引物通过链置换进行DNA合成。BIP与在上面形成的DNA链结合，从BIP的3＇端开始合成互补DNA链。通过这个过程，DNA由环状结构恢复成线性结构。B3引物在BIP的外侧通过DNA聚合酶的活动从3＇端开始进行复性过程，BIP合成的DNA在B3引物合成DNA之前被置换释放出来。经过上面的过程就产生了双链DNA。而BIP结合的互补链被置换后在两端各自形成环茎结构，类似于哑铃结构，如图2。

图2 哑铃结构

哑铃结构是LAMP循环的起始结构，它以自身为模板，由3’末端F1启动合成；与此同时，FIP结合于哑铃状结构的F2c上启动合成。随后，在哑铃结构中新合成的3’末端B1c与B1互补形成茎环结构，并以B1引物自身为模板启动合成，并释放出刚刚FIP引导合成的互补链。如此往复，形成新的茎环结构又引导合成互补链。最终形成许多长短不一的DNA链，但都是靶基因的整数倍。如图3。

图3 LAMP循环过程

1.3 产物分析 LAMP方法扩增产物的检测可通过以下4种方式进行：（1）LAMP扩增副产物焦磷酸镁为白色沉淀，可肉眼观察，如果有扩增产物，可以看到白色沉淀；反之，则没有；（2）SYBR Green I检测，在反应液中加入SYBR Green I，可在紫外灯或日光下通过肉眼进行扩增结果判定。如果含有扩增产物，反应混合物变绿；反之，则保持SYBR Green I的橙色不变；（3）副产物焦磷酸镁的浊度检测，这种检测方式具有极高的特异性，使用浊度仪可以判断扩增发生与否，也可进行实时监控；（4）琼脂糖电泳检测，LAMP扩增产物为靶基因的整数倍，扩增产物经琼脂糖电泳后形成特征性梯状条带。

2 LAMP方法在寄生虫检测上的应用

近年来，LAMP方法在寄生虫检测上的应用得到了快速发展，表1列出了一些学者用LAMP方法检测寄生虫的一些内容。

2.1 原虫

2.1.1 锥虫 Thekisoe等［2］用不同方法检测实验感染猪的伊氏锥虫，结果表明LAMP方法同样具有较好的特异性和敏感性。Thekisoe等［6］后来又建立了种属特异性锥虫病的LAMP检测技术，用于检测布氏冈比亚锥虫、刚果锥虫、克氏锥虫和伊氏锥虫，可以检测锥虫DNA的最低限度是1fg，在锥虫病的田间和实验室诊断中具有很好前景。

2.1.2 隐孢子虫 隐孢子虫病是一种重要的人兽共患病，据报道［31］会导致艾滋病等免疫缺陷或抑制病人的因严重腹泻而死亡。Karanis等［8］等利用LAMP技术进行了动物隐孢子虫的检测研究，根据微小隐孢子虫60－kDa糖蛋白（gp60）基因设计引物，并以蒸馏水、正常牛血、布氏锥虫、牛巴贝斯虫等作为对照，验证LAMP方法的特异性，结果只有微小隐孢子虫电泳出现梯状条带。其研究还进行了敏感性实验，证明LAMP方法至少可以检测到一个卵囊。所建立的方法可以快速对动物粪便和环境样品判断是否有隐孢子虫，方便调查隐孢子虫病的流行情况。

2.1.3 弓形虫 人的先天性弓形虫病在胎儿或婴儿可出现发育畸形、智力障碍、脑炎甚至死亡等临床症状。Sotiriadou等［11］建立了检测水中弓形虫的LAMP方法。根据B1和TgOWP基因建立的方法检测极限为0.1个速殖体的DNA，与巢式PCR同时检测26个含有已知数目卵囊的水样，LAMP的检出率为100%，而巢式PCR为53.8%；又用自然水样来比较LAMP、PCR和免疫荧光试验3种检测方法，结果LAMP方法弓形虫检出率明显高于另外两种方法。

2.1.4 泰勒虫 Thekisoe等［14］利用小泰勒虫的PIM和p150基因建立LAMP方法，分别设计引物，每组靶基因引物包括6个引物，可以识别靶基因上的8个不同区域，这样可以高特异地检出小泰勒虫。每个引物组的检出限度是1fg，相当于小泰勒虫PIM或p150基因的1个拷贝。利用PIM和p150设计的LAMP引物组可以从不同国家的家畜和水牛隔离群中扩增出小泰勒虫。

2.1.5 巴贝斯虫 Iseki等［17］设计了针对牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫棒状体联合蛋白－1基因（rhoptry－associated protein－1genes）的两套 LAMP引物，进行扩增试验，两条引物完成了各自的扩增，并且通过后来的酶切片段不同加以区分，建立了同时检测牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫的多重LAMP方法。此法检测牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫的敏感性比常规PCR分别高出103和105倍。

2.1.6 疟原虫 疟疾是世界六大热带病和我国五大寄生虫病之一，人体的疟原虫有4种：间日疟原虫、恶性疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫。Han等［20］用根据人疟原虫18SrDNA建立LAMP方法可以检测人体的4种疟原虫，检测三日疟原虫、卵形疟原虫的极限为10拷贝，而对于恶性疟原虫和间日疟原虫的检测极限为100拷贝。与显微镜检相比其显示了较高的敏感性和特异性；与巢式PCR相比其检出率相符，但出结果时间更短。

表1 近年来LAMP方法在寄生虫检测中的一些应用

2.1.7 孢子虫 杨秋林等［24］根据卡氏肺孢子虫线粒体核糖体大亚基（mtrRNA）基因设计引物利用LAMP方法检测该虫。以结核杆菌、弓形虫、大鼠白细胞等为对照，将卡氏肺孢子虫DNA 10倍稀释后同时进行LAMP和PCR，比较两者的敏感性。结果卡氏肺孢子虫检测为阳性，对照组均为阴性。卡氏肺孢子虫LAMP产物经电泳后呈特征性梯状条带，扩增产物经Tail限制性内切酶酶切鉴定正确，对照组也均无扩增产物。LAMP可检测到虫体DNA的最低浓度是1Pg/μL，为PCR的10倍。

2.1.8 贾第虫 卢潍媛等［26］根据蓝氏贾第鞭毛虫rRNA序列设计4条特异引物建立了检测该虫的LAMP方法。以隐孢子虫卵囊、疟原虫为对照，并将纯水作为阴性对照，结果蓝氏贾第鞭毛虫检测为阳性；对照组均为阴性。且与LAMP产物琼脂糖凝胶电泳分析结果一致。

2.2 吸虫 Cai等［28］利用华支睾吸虫组织蛋白酶B3基因建立LAMP的方法能够敏感、快速的检测鱼是否感染华支睾吸虫，而且实验中的肝片吸虫、日本血吸虫等对照没有发生交叉反应，试验中LAMP检测华支睾吸虫的敏感性为常规PCR的100倍。该方法为检测鱼的华支睾吸虫提供了一个快速、敏感的工具，这为预防人的华支睾吸虫病提供了有效的手段。

2.3 绦虫 Nkouawa等［29］根据绦虫组织蛋白酶样半胱氨酸肽酶（CLP）和细胞色素C氧化酶亚基1（Cox1）基因设计LAMP引物，建立的检测绦虫的LAMP方法。其中根据Cox1基因建立的LAMP方法可以区分3个种，而根据CLP基因建立的LAMP可以区分有钩绦虫和无钩绦虫或亚洲带绦虫，通过限制性酶消化LAMP产物又可区分无钩绦虫和亚洲带绦虫。

2.4 线虫 郑洋妹等［30］根据简单异尖线虫ITS保守区域序列设计引物建立了快速鉴定该虫的LAMP方法。优化后对10倍比稀释的简单异尖线虫ITS序列重组质粒进行灵敏性试验；用典型异尖线虫、对盲囊线虫、针蛔线虫作为对照进行特异性试验；并将7份简单异尖线虫样品进行验证试验。结果检测简单异尖线虫的灵敏度达到10拷贝/μL，且对照均无交叉反应，7份简单异尖线虫样品检验为阳性。所建立的LAMP方法灵敏性高、特异性强，是鉴定简单异尖线虫的有效手段。

3 展 望

LAMP作为一种新颖的核酸扩增方法，在短短10年内，以其显著优势被研究者们广泛应用于分子检测，其发展前景非常广阔。虽然它的引物设计过程繁复，但是引物设计可以由相关研究单位和试剂公司来完成，对于操作人员来说是极为简单，只需要把处理好的样本和LAMP相关试剂一起放入65℃恒温水浴中，1h左右就能通过肉眼报告结果。这点作为临床检测具有很大意义，可开发成LAMP检测试剂盒，便于广大基层医疗卫生单位检验人员使用。总之，随着LAMP技术的不断完善和改进，相信LAMP方法将在寄生虫病的分子诊断及检测中发挥更大的作用。

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R181.2

A

1002－2694（2011）10－0935－05

＊河南省科技厅重点科技攻关项目（92102110138）资助

菅复春，Email：jfchun2008＠yahoo.com.cn

河南农业大学牧医工程学院，郑州 450002

2011－03－16；

2011－06－02