丹参多酚酸盐及神经肽Y干预后癫痫大鼠海马神经肽Y的表达变化

陈丽丽,黄靓妹,詹红艳,曹亦宾,张 宏

(唐山工人医院 1.神经内科;2.急诊内科,河北 唐山 063000）

癫痫是由于脑部神经元异常过度放电所致的突然、反复和短暂的中枢神经系统功能失常的慢性疾病和综合征。神经肽Y(neuropeptide-Y,NPY）是由36个氨基酸残基组成的多肽,广泛分布于哺乳动物中枢和外周神经系统,是含量最丰富的神经肽之一。研究发现NPY与癫痫密切相关,癫痫发作后海马中NPY释放量明显增多,且对癫痫有保护作用。丹参多酚酸盐注射液是国家二类中药新药。自2005年5月获批应用以来,证实它具有抗血小板聚集、抗血栓形成、改善微循环、抗氧化损伤的作用。本课题拟采用免疫组织化学方法观察PILO所致大鼠NPY的表达,探讨丹参多酚酸盐及NPY干预注射对海马NPY的表达影响研究,进一步探讨内在抗癫痫机制及外在抗癫痫药物的作用,为癫痫治疗提供形态学依据。

1 材料和方法

1.1 材料

健康雄性成年Wistra大鼠20只,体重200-250 g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。将动物置于20℃、安静的环境中饲养。匹鲁卡品(PILO）,美国SIGMA公司;神经肽Y,美国SIGMA公司;兔抗大鼠NPY蛋白质多克隆抗体,武汉博士德公司;SABC免疫组化试剂盒,武汉博士德公司。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组 随机分为(1）NPY干预组5只,用2%戊巴比妥钠0.1 m/50 g将大鼠麻醉,立体定位仪上固定,依次切开皮肤、皮下组织,钝性分离骨筋膜,按大鼠解剖图谱Fig22取前囟后2.0 mm、左旁开1.0 mm,手术刀钻开颅骨,校准微量进样器垂直度后,抽取NPY 10 μ l(即6 nmol）,垂直进针至硬脑膜下3.5 mm(左侧脑室）,缓慢注射,于10-15 min内注射完毕,留针2 min后拔出进样器,撒上青霉素粉防感染,缝合皮肤,放回饲养笼内;第二天腹腔注射匹鲁卡品(PILO）350 mg/kg,注入前30 min腹腔注入东莨宕碱1 mg/kg,以拮抗其外周胆碱能反应,观察癫痫发作情况。(2）丹参多酚酸盐干预组5只,同样方法侧脑室注射丹参多酚酸盐10 mg/kg 1 h后,第二天腹腔注射PILO350mg/kg,注入前30min腹腔注入东莨宕碱1 mg/kg,以拮抗其外周胆碱能反应,观察癫痫发作情况。(3）生理盐水干预组5只,用上述同样的方法行侧脑室注入等量生理盐水,第二天腹腔注射PILO350 mg/kg,以后观察有无癫痫发作。(4）对照组5只,大鼠腹腔注射等量的生理盐水,注入前30 min腹腔注入东莨菪碱1 mg/kg,观察癫痫发作情况。腹腔注药后立即观察大鼠有无癫痫发作,按 Racine[1]制定的标准判定。共观察12 h。记录发作时间及次数。

1.2.2 标本处理 实验动物均于腹腔注药后立即观察有无癫痫发作,12 h后用2%戊巴比妥钠0.1 ml/50 g将大鼠麻醉,获取标本。步骤如下:在立体定位仪上固定,剪开胸腹腔,暴露心脏、肝脏,取灌注针自心尖向右上45°进针至主动脉起始端。快速灌注生理盐水100 ml-200 ml后接4%多聚甲醛(PF）200 ml灌注,至大鼠四肢强直、肝脏变白后停止灌注,拔出穿刺针。仔细剪开颅骨,取中脑至小脑之间脑组织,放入4%PF后固定2 h以上,移入30%蔗糖溶液4℃过夜。

1.2.3 冰冻切片 冰冻切片机温度调至-18～-16℃后,将已沉底脑组织修材,固定于基座上,自中脑向后行20 μ m冠状连续切片,并放入磷酸盐缓冲液中用于NPY免疫组化,并都置于4℃冰箱保存备用。

1.2.4 神经肽Y的SABC免疫组织化学染色 组织片飘浮于PBS配制的1%H2O2中,室温下10 min消化内生过氧化物酶,PBS加0.3%TritonX-100 5 min/次洗1次,PBS 5 min/次洗 2次;室温下加正常山羊血清封闭抗原20 min;然后加1∶500兔抗大鼠NPY多克隆抗体4℃过夜,PBS加0.3%TritonX-100 5 min/次洗3次;加1∶100生物素化羊抗兔IgG抗体37℃孵育 30 min,PBS加 0.3%TritonX-100 5 min/次洗3次;加1∶200链霉素亲和素-生物素复合物(SABC）37℃孵育30 min;PBS 5 min/次洗3次,TBS 5 min/次洗1次,0.2%CoCl2中放置10 min,TBS 5min/次洗2次,PBS 5min/次洗3次,DAB避光显色5-10 min,镜下观察至效果满意,PBS终止反应。贴片干燥经脱水、透明后中性树胶封片。用PBS取代一抗作阴性对照。置换试验用正常兔血清代替兔抗大鼠NPY抗体。

NPY阳性细胞计数:在光学显微镜下,每组随机选取6张切片5个高倍视野。计算海马齿状回门区、CA3、CA1区每个高倍视野下的NPY阳性细胞数。

1.3 数据分析

所有数据均使用SPSS 13.0软件进行统计分析。数据表示为¯x±s。NPY阳性细胞数均数各组间两两比较行t检验,组间比较行ANOVA方差检验,统计显著性为P＜0.05。

2 结果

2.1 行为学观察

根据Racine制定的标准判定癫痫发作:0级:无惊厥;Ⅰ级:面部阵挛;Ⅱ级:面部阵挛+节律点头;Ⅲ级:面部阵挛+节律点头+前肢阵挛;Ⅳ级:面部阵挛+节律点头+前肢阵挛+后肢站立;Ⅴ级:面部阵挛+节律点头+前肢阵挛+后肢站立+跌倒。盐水干预组5只大鼠在注射PILO后10-20 min均见癫痫发作,而且1 h达到Ⅴ。丹参多酚酸盐组4只大鼠在注射PILO后30-40 min见癫痫发作,但程度较弱,达到Ⅱ-Ⅲ。NPY干预组有3只大鼠在注射PILO后50-60 min癫痫发作至Ⅱ级。对照组无癫痫发作。

表1 按Racine分级标准的行为学观察

2.2 NPY免疫组化结果

各组海马门区、CA3区、CA1区NPY阳性细胞数(见表2）,生理盐水及丹参多酚酸盐干预组均可见到颗粒细胞异位表达的NPY。干预方法不同,海马NPY阳性细胞数表达不同(F=9.853,P＜0.05）。NS、丹参多酚酸盐干预组NPY阳性细胞数高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05）;丹参多酚酸盐组高于生理盐水干预组,差异有统计学意义(P＜ 0.05）。见图1。

图1 NPY阳性细胞数形态(NPY免疫组化染色,×400）

表2 各组 NPY阳性细胞数(±s）

表2 各组 NPY阳性细胞数(±s）

注:干预组各区比较,(F=54.815,F=372.253,F=115.253,P＜0.05）,差异有统计学意义;对照组各区比较(F=52.985,P＜0.05）,差异有统计学意义。

分区 NPY干预组(n=5）NS干预组(n=5）丹参多酚酸盐干预组(n=5）对照组(n=5）门区 8.320±2.853 20.160±3.216 29.250±4.20110.189±3.204 CA3区 2.381±1.6586.800±1.418 12.135±4.127 3.128±1.148 CA1区 1.726±1.3214.540±2.938 9.651±3.107 2.684±1.0275

3 讨论

正常大鼠海马齿状回门区、CA1、CA3区有NPY的表达,而且主要在抑制性神经元中表达[2],颗粒细胞中无表达,不能观察到NPY免疫反应性变化。本研究发现,癫痫发作后海马齿状回门区、CA1、CA3区有NPY的表达,且颗粒细胞层有NPY的异位表达(NPY-IR）。有研究发现[3],癫痫发作后NPY-IR明显增多,可能是以下两方面的原因,一是由于NPY的生物合成增多,二是由于NPY的释放减少。在NPY-IR增强的同时相应的细胞内的NPY-mRNA也增多,从而提示NPY的生物合成增强。在致大鼠癫痫的所有模型中,在大鼠脑内海马苔藓纤维的病理改变中发现,无论急性期、静止期,还是慢性期,NPY在整个发作过程中持久表达[4]。研究发现[5],内源性神经肽Y在调控兴奋性上起着重要作用,癫痫大鼠模型中海马NPY的含量与癫痫的发作程度和发作形式相关。发作程度越重,NPY的表达增多。这有可能与机体抵抗癫痫的的发作而代偿性增加有关。一般情况下,癫痫发作后激发机体产生NPY,本实验中侧脑室注入外源性NPY后,在腹腔注射PILO后癫痫发作程度明显减轻或是无癫痫发作,所以NPY表达减少,且海马区NPY阳性细胞数明显低于盐水干预组,差异有统计学意义(P＜0.05）。提示NPY有直接抗癫痫作用。本研究颗粒细胞层无NPY的异位表达,支持癫痫发作后颗粒细胞层NPY的表达不是药物或者细胞损伤的结果,而是由癫痫活动激发的结果。表明癫痫发作后海马内NPY的增加是一种代偿性的抗癫痫作用。Woldbye[6]研究中观察戊四氮致痫大鼠一侧侧脑室注射NPY后,明显延长了痫性发作的潜伏期,并降低了死亡率。另有研究也证实[7],侧脑室注入NPY可显著缩短癫痫发作时间及程度。

[1]Racine RJ,Gartner JG,Burnham WM.Epileptiform activity and neural plasticity[J].Epilepsia,2005,46(5）:452.

[2]Cabrele C,Beck-Sickinger AG.Molecular characterization of the ligandreceptor interaction of the neuropeptide Y family[J].J-Pept,2000,6(3）:97.

[3]Schwarzer G,Kofler N,Sperk G,et al.Up-regulation of neuropeptide YY2 receptors in an animal model of temporal lobe epilepsy[J].Mol.Pharmacol,1998,53(1）:6.

[4]Boeck,Carina R-Ganzella,Marcelo.NMDA preconditioning protects against seizures and hippocampal neurotoxicity induced by quinolinic acid in mice[J].Epilepsia,2004,45(7）:745.

[5]Williams PA,Don P,Dudek F,et al.Epilepsy and synaptic reorganization in a perinatal rat model of hypoxia-ischemia[J].Epilepsia,2004,45(10）:1210.

[6]Woldbye DPD.Antiepileptic effects of NPY on pentylenetetrazole seizures[J].Regul Pept,1998,75-76:279.

[7]段瑞生,金 善,迟兆富.脑室内灌注神经肽Y对戊四氮致痫大鼠海马内脑源性神经生长因子表达的影响[J].脑与神经疾病杂志,2002,1095）:275.