香菇多糖抗胃癌机制研究

冯 燕,全吉钟,王冬旭,吕晓鹏

(吉化集团公司总医院放化疗科,吉林吉林 132022）

胃癌是我国常见的恶性肿瘤,全世界35%胃癌发生在中国,年发病30多万,年胃癌死亡超过26万。免疫治疗可通过直接抑制肿瘤细胞及增强机体免疫功能等作用治疗肿瘤,同时协同放化疗可减轻放化疗毒性。本研究通过香菇多糖对人胃癌细胞株BGC-823增殖活性、人胃癌细胞株BGC-823凋亡分子Bcl-2、BaxmRNA 及免疫抑制因子 TGF-β、VEGF mRNA表达及对小鼠脾细胞的增殖活性的影响探讨其抗肿瘤的分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料

细胞株BGC823(人胃癌细胞株）,小鼠均为吉林大学基础医学部提供;主要实验药品:香菇多糖1 mg/2 ml,金陵药业股份有限公司;PCR引物序列bax:上游引物:3'-gtccaccaagaagctgagc-5',下游引物:3'-agtagaagagggcaaccac-5';bcl-2上游引物3'-gacagaagatcatgccgtcc-5',下游引物3'-ggtaccaatggcacttcaag-5';TGF-β上游引物 3'-acctttgccgagggttcc-5',下游引物3'-tagatggcgttgttgcggt-5';VEGF上游引物3'-ttcatggatgtctatcagcg-5',下游引物3'-gctcatctctcctatgtgct-5'。

1.2 实验方法

1.2.1 MTT法检测细胞增殖活性 采用MTT比色分析。将对数生长期胃癌BGC823细胞株的细胞悬液调浓度至3×105/ml。取96孔平底培养板,设:①对照组(不加药组）:共3复孔,每孔加无血清的DMEM培养液20 μ l,并每孔加入含 10%血清的DMEM培养液90 μ l;②加用香菇多糖组:共 6个浓度,分别为 1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10 000、1∶100 000,从高到低进行稀释,每个浓度3复孔,每孔加入20 μ l,并每孔加入含10%血清的DMEM培养液90 μ l。然后,各孔分别加入90 μ l细胞悬液。将培养板移入CO2培养箱中培养,在37℃5%CO2饱和湿度条件下孵育44 h后,各孔加入MTT溶液(5 mg/ml）10 μ l,继续孵育 4 h后终止培养,小心吸弃孔内上清液,每孔加入 100 μ l DMSO,振荡 10 min。选择570 nm波长,在酶标仪上测定各孔光OD值,记录结果,绘制表格。小鼠脾细胞增殖活性测定方法同上。

1.2.2 流式细胞术检测细胞周期及凋亡 将对数生长期的胃癌细胞株BGC-823的细胞悬液调浓度至3×105/ml,接种于培养瓶中,设二组:①对照组;②香菇多糖作用组(终浓度为1∶10）。每组3瓶,在香菇多糖作用后48 h对细胞进行消化计数。以PBS洗三遍,调细胞浓度为1×106/ml,0.5 ml PBS重悬细胞,70%(体积分数）冰乙醇固定细胞过夜,加入RNAase至终质量浓度0.05 g/L,37℃恒温水浴1 h,加入PI至终质量浓度0.05 g/L,4℃避光染色1 h,上流式细胞仪分析,使用200 mW氩离子激光,波长488 nm,资料用CELL TIL细胞周期分析软件处理。检测细胞周期及凋亡情况。

1.2.3 RT-PCR技术检测凋亡分子及免疫抑制因子mRNA表达 将对数生长期胃癌细胞株BGC-823的细胞悬液调浓度至3×105/ml,接种于6孔板中,设二组:①对照组;②香菇多糖作用组(终浓度为1∶10）。每组3复孔,在37℃5%CO2恒温培养箱中常规培养。在香菇多糖作用48 h时终止培养,收获细胞,提总 RNA 并合成 cDNA。采用Bcl-2、Bax、TGF-β、VEGF各基因相应引物进行PCR扩增。反应结束后,各取8 μ l PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,EB染色30 min,采用影像分析仪观察结果。

1.2.4 统计学处理 各组实验数据均用均数±标准差(¯x±s）表示。两组间差异显著性分析用两样本均数差别的t检验,P＜0.05表示有显著性差异。数据分析采用SPSS11.0软件进行统计。

2 结果

2.1 香菇多糖对人胃癌细胞株BGC823增殖活性的影响

结果表明,1∶10浓度的香菇多糖作用于胃癌细胞BGC823能显著抑制细胞增殖(P＜0.01）,见表1。

2.2 香菇多糖对人胃癌细胞株BGC-823细胞周期及凋亡的影响

香菇多糖作用于BGC-823细胞48 h后,G1期细胞比率由66.51%下降至65.75%,S期细胞比率分别由33.41%上升至34.08%,细胞增殖无明显变化。香菇多糖可以促进胃癌细胞BGC823凋亡:在香菇多糖作用于胃癌细胞24 h后凋亡细胞百分比分别由0.55%增加至4.84%,结果见图1。

2.3 香菇多糖对人胃癌细胞株BGC-823凋亡分子Bcl-2、BaxmRNA 及免 疫抑制因 子 TGF-β 、VEGF mRNA表达的影响

电泳结果显示,相对于正常对照组细胞,香菇多糖组细胞中抑凋亡因子Bcl-2 mRNA表达明显减少,促凋亡因子Bax mRNA表达明显增加,并可下调人胃癌细胞株BGC-823免疫抑制因子TGF-β、VEGF mRNA,见图 2。

表1 不同浓度LTN对胃癌细胞株BGC-823增殖的影响

图1 香菇多糖对BGC-823细胞周期及凋亡的流式细胞术分析

图2 香菇多糖作用前后胃癌细胞BGC-823中Bax,Bcl-2,VEGF、TGF-βmRNA 表达的影响

2.4 香菇多糖对小鼠脾细胞的增殖活性的影响

结果表明:1∶10浓度的香菇多糖对小鼠脾细胞细胞的增殖有显著促进作用(P＜0.05）,见表2。

表2 LTN对小鼠脾细胞增殖活性的影响

3 讨论

本实验通过细胞与分子水平研究表明一定浓度香菇多糖可以通过上调促凋亡因子Bax、下调抗凋亡因子 Bcl-2的表达诱导肿瘤细胞凋亡,从而抑制胃癌细胞BGC-823的增殖;一定浓度香菇多糖可显著促进小鼠脾细胞增殖活性发挥免疫调节作用;可下调人胃癌细胞株BGC-823免疫抑制因子VEGF、TGF-βmRNA的表达逆转免疫抑制。

免疫药物可增加患者的抗感染和抗肿瘤能力,国内贾均等对22例肿瘤放化疗病人进行免疫治疗结果显示:不仅病人淋巴结细胞表型中CD3+,CD4+,CD4/CD8+升高,而且参与细胞凋亡的CD15+也有明显增高.香菇多糖主要是通过增强诱导活化的巨噬细胞及CTL细胞,提高NK细胞活性和增强抗体依赖性巨噬细胞毒作用来发挥抗肿瘤作用。肿瘤细胞的发生、发展过程受多种因素影响,主要表现为细胞增殖失控、分化受阻、凋亡紊乱三个基本特征。目前一般认为,在恶性肿瘤发生和发展过程中,细胞凋亡抑制比细胞过度增殖所起的作用更重要。诱导肿瘤细胞分化、凋亡的相关研究也已成为近几年的抗肿瘤研究的热点之一。

免疫抑制因子可以不同程度抑制免疫细胞活性和抑制免疫效应的产生。肿瘤细胞自身亦可分泌、释放一些具有免疫抑制作用的免疫抑制因子,如:VEGF、IL-10、TGF-β等直接参与机体的免疫抑制 ,且具有异质性,这些抑制因子积累聚集于肿瘤局部,形成一个较强的免疫抑制区,使进入其中的免疫细胞失活。同时免疫抑制因子VEGF还参与肿瘤新生血管的生成,VEGF及其受体(VEGFR）和VEGF的mRNA存在于多种肿瘤中,在肿瘤细胞,其表达量与肿瘤的恶性程度呈正相关。Bax与Bcl-2同族但功能相反,Bax具有促进细胞凋亡的功能,当Bax表达增加时,形成同源二聚体,促进细胞的凋亡。所以与一般癌基因和抑癌基因不同,Bcl-2和Bax不是通过调节细胞增殖,而是通过调控细胞凋亡来调节肿瘤细胞生长状态的。与其起源组织相比,多数肿瘤的Bcl-2表达升高,而bax表达下降,Bax/Bcl-2比例下调在肿瘤的发生和发展中具有一定意义。

恶性肿瘤为基因突变的产物,因此探寻其发生发展以及治疗,终需通过分子水平的研究来完成.本研究揭示了香菇多糖抗肿瘤效应及其分子机制,为香菇多糖辅助进展期胃癌术后放化疗提供了理论基础与实验依据。

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